在关于玛丽是否应该为谋杀达恩利负责的争论结束后，伊丽莎白决定对玛丽采取质询而不是审判来解决问题。1568年10月至1569年1月间，对玛丽的质询在约克实行。这场质询具有极强的政治色彩。伊丽莎白并不希望玛丽被判谋杀罪，而玛丽，因为她曾经受过教会的涂油礼，拒绝承认任何世俗审判的权威性。莫里伯爵詹姆士·斯图尔特，最终负责对玛丽进行起诉，他同时也掌管玛丽缺位时的苏格兰，其主要任务是不让玛丽返回苏格兰并控制那些支持玛丽的苏格兰人民。
审判的重心逐渐转移到“首饰盒信件”一事上，詹姆斯·道格拉斯，莫顿伯爵四世在爱丁堡一个雕有F字样的（据推断是法兰西斯二世）银盒里，发现了据称是玛丽写给伯斯维尔的八封信和许多其他文件，包括玛丽和伯斯维尔的结婚证明。法庭上玛丽并没有看到这些证物，也不能为自己辩护。她拒绝提交一份书面的抗辩词除非伊丽莎白宣判她无罪，显然，伊丽莎白不可能那么做。
尽管质询方通过验证笔迹认定首饰盒信件为真迹。其中的内容也摆在那里，如果其中的内容是可信的话，这些都会成为玛丽有罪的证据。但质询方最后得出结论是没有足够的证据证明玛丽是有罪的。其实结果并不出人意料，唯一的结论就是这些都只不过为了取悦伊丽莎白。
后世诸多历史学家质疑“首饰盒信件”的真实性。但原件已于1584年失传了，众多的抄件散失在很多收藏家中但并没有形成完整的一套。玛丽质疑她的笔迹并不难于模仿，并经常流露出这些信札统统都是伪造的，有罪的段落是在质询前嵌入书信中的。或者这些信是其他人写给伯斯维尔的。通过写作风格的对比就能看出他们不是出自玛丽之手。
现在，无论何种方式都不可能证明这些信件的真假了。除了这些信件，并无其他证据可以控告玛丽。事后看来，很难证明涉及的主要当事人想去探清事情的真相。
伊丽莎白认为玛丽图谋染指英格兰的王位并对她造成了威胁。此后玛丽被她囚禁了十八年。其中大部分时间，玛丽被软禁在谢菲尔德城堡和谢菲尔德庄园。在乔治塔尔伯特，什鲁斯伯里伯爵六世和他可怕的夫人，哈德威克的贝斯的监视下。他们的女儿伊丽莎白卡文迪什嫁给了查尔斯斯图亚特（达恩利的兄弟）并育有一女，阿尔贝拉小姐。女王的至爱——詹姆斯·赫伯恩则被囚禁在了丹麦，患上了“精神病”，最后死于1578年。当时也身陷囹圄，1580年，软禁玛丽的责任被转交到了阿米爱斯伯勒特手中。玛丽在他的“关怀”下度过了余生。
不管如何，1570年，法国国王查理九世派代表劝说伊丽莎白许诺帮助玛丽重新获得她的王位，作为前提条件，玛丽要接受她仍不十分赞同的爱丁堡条约。不过，威廉·塞西尔，一世伯利作为伊丽莎白的代表与玛丽协商。两位女王始终没有见过面。
莱道菲阴谋使得伊丽莎白不得不重新考虑如何处置玛丽。1572年，议会在女王的鼓励下，订立了一道禁止玛丽成为英格兰女王的法案（即“联合合约”），其目的在于预防任何可能在刺杀女王中得益的继位者。这道法案并不是法令，但数以千计的人在上面签字，包括玛丽自己。
伊丽莎白再也不能容忍玛丽，因为她收到许多报告，有人阴谋谋害她本人而让玛丽取而代之。
玛丽斯图亚特于1587年2月8日在北安普敦郡佛斯里亨城堡被处极刑，罪名是被怀疑卷入阴谋，贝比通阴谋，企图刺杀伊丽莎白。行刑那天，玛丽身着红色，表明她是一个天主教殉教者。
行刑过程是很残酷的，一些人事后回忆说那天刽子手喝醉之后长喘三口大气才把玛丽的头砍下来，当第一斧头下去，据传她用喉咙喃喃作声说：“刽子手，做完你的事儿！”关于这场行刑有很多其他版本，但经久不衰延续至今的版本是：当刽子手拿着玛丽面容冷峻的头颅向在场的人展示的时候，这才发现玛丽戴了一个假发头套（戴着假发，就像她平时那样）。刽子手抓着一束玛丽的毛发从而拎着她的头。却发现死去的女王的嘴还对着下面的祈祷者在动。另一个事件玛丽的小猎犬躲在她的裙子里，当玛丽被处刑时因为痛苦而逃了出来，反复清洗几次才将粘在它毛发上的女主人的血迹清除。那只小猎犬立即被制成木乃伊，可怜的动物，现在还保存在大英博物馆。
玛丽最初被埋葬在彼得镇大教堂，但是她的遗体于1612年被她的儿子，英格兰国王詹姆士一世挖掘出来了，迁葬到威斯敏斯特教堂。现在仍在那儿，她的墓穴和她表姑伊丽莎白的只有30英尺之遥。
玛丽死后被封为圣徒，跻身耶稣会殉难者之列，现存还有很多玛丽的遗物，她的祈祷书长期以来在法国展示，她的辩护书也已出版。在英语刊物中，她所做的十四行诗已经出版，在这本书里据说有她的亲笔。
一位着名的德国女演员，亨德尔·席勒茨被玛丽的人生态度所感染并开始钦佩玛丽的为人，她在弗里德里希·席勒一剧中饰演“玛利亚”在德国众多城镇中赢得一致好评。据称她所佩戴在脖子上的十字架挂件与不幸的玛丽女王所佩戴的极其相似。
在众多遗物中很少有确凿证据证明是玛丽女王曾经使用过的。但是还是有一些遗物被证实确实是女王曾经所有的。比如在行刑后覆盖在女王脸上的面纱。不知道是由于刽子手手忙脚乱还是当时环境的混乱，误伤了这位不幸女王的肩膀。这块面纱原本是J.C希匹斯雷爵士所有，他声称他母亲是斯图亚特王朝的后代，1818年，在罗马，马提奥戴奥塔夫雕刻了一尊以他形象为蓝本的木雕，并将这尊木雕的复制品赠送给他的朋友。
面纱上金边闪烁的饰物据说是由玛丽女王亲手缝制的，整齐地挨个排列着，由此可以形成一个个小的方格。方形地边角镶金。边角相连。其上有金字绣成的一段话。
木雕上有一段题字，从另一方面证明了这件遗物的真实性，上面写着，这个面纱，是被驱逐了的斯图亚特王朝的传家之宝。被这个家族最后的遗脉约克的天主教枢机主教，亨利·本尼迪克特·斯图亚特保存，多年以来，他将这件至宝保存在他个人的小礼拜堂里，其中还有诸多其他玛丽女王的遗物，他死后，将这些遗物，连同一本珍贵的古希腊历史学家普卢塔克着作，和一本精装印制的圣书抄本，还有一些在苏格兰玛丽女王时期铸造的金币，一并赠送给约翰·希彼斯里爵士。
自1818年4月29日以后，这个木雕一直由教皇庇护七世收藏在他位于奎里纳尔山的宫殿内，先前当他住在罗马时曾与约克枢机相厚，当约克枢机和其他枢机于1798年移居威尼斯的时候，英国国王乔治四世，当时的威尔士亲王给予了那些因为法国大革命而生活窘迫的枢机主教一年4000英镑的养老金。
约克枢机想把这些他认为价值连城的玛丽女王的遗物赠送给那些给他们提供帮助的人作为报答。根据在这个木雕上的纸条上所说，这块面纱长为89英寸，43英寸宽，因而看上去更像是披肩或者围巾而非面纱。在梅尔维尔的记忆中，也是席勒读到的，所提到的属于女王的手帕在女王死前就被人拿走了，席勒还发现在这块面纱上所记录的由汉娜肯尼迪所做的一些着名的描述永别场面的句子。
“接受这块我亲手传递的手帕！
这块我在悲伤时刻为你亲手缝制的手帕
其中交织着我的热泪：
它让我永不瞑目。”
有关玛丽女王生平的两部经典电影（两者都没有基于历史事实而是从故事中取材）分别是1936年拍摄的《苏格兰的玛丽》，由凯瑟琳·赫本和弗里德里克·马歇出演，还有一部是1971年拍摄的《玛丽：苏格兰女王》。由瓦内莎·里德格瑞夫（获得奥斯卡金像奖）和奈杰尔·达文波特出演。玛丽的事迹也引起了戏剧界的关注，多尼采蒂·盖尔塔诺写作了以玛丽斯图亚特为名的歌剧。弗里德里克·席勒写作了剧本《玛利亚·斯图亚特》。诗人约瑟夫·布罗德斯凯用俄语写作的写给玛丽斯图亚特的十四行诗获得了诺贝尔文学奖，使人将玛丽设定为一个对话者。同样，玛丽的事迹激励了麦克沃德弗里德写作了歌曲“致法国”。
玛丽是英格兰和爱尔兰女王、都铎王朝第四位和倒数第二位君主（1553年7月6日－1558年11月17日，实际上任在7月19日）。她于其同父异母弟弟爱德华六世死后继承英国君主宝座，再次于英格兰复辟罗马天主教。过程中，她下令烧死约300名宗教异端人士。此举动为她得来“血腥玛丽”的绰号。可是，玛丽苦心经营的罗马天主教在她死后由伊丽莎白一世再次由新教所取代。
玛丽是亨利八世和第一任妻子凯瑟琳王后（阿拉贡的凯瑟琳）唯一幸存的孩子。在玛丽出生以前，凯瑟琳王后曾多次流产，一名女婴早夭，三名男婴夭折。玛丽是阿拉贡的斐迪南二世和卡斯蒂利亚的伊莎贝拉一世的外孙女。她在伦敦的格林威治出生，教父为红衣主教托马斯·沃尔西。童年时的玛丽是一个体弱多病的孩子，患有眼疾，鼻窦有毛病，亦经常为头痛所苦。
纵然健康不太理想，玛丽仍然是一个早熟的小孩。她良好的教育大多归功于凯瑟琳王后，她亦是玛丽的第一位拉丁语老师。除此以外，玛丽亦有学习希腊文、科学及音乐。1521年7月，当玛丽还不过是5岁半时，已能在王宫的宾客前演奏古键琴，为父亲赢尽面子，亦因而深受他的宠爱。她9岁的时候，父亲亨利八世赐予她威尔士公主的称号。在英国历史中，这一直是王储的头衔。尽管亨利十分疼爱玛丽，他仍然因无男性后嗣而甚感失望。
早于玛丽还小时，亨利八世已为她的婚事张罗。在她2岁的时候，她与法国王太子，即法国国王弗朗索瓦一世的儿子订婚。但3年后，婚约宣告无效。1522年，她被安排与22岁的表哥，神圣罗马帝国的查理五世缔结婚约，唯数年后，查理五世与一位葡萄牙公主结婚，与玛丽的婚事因而告吹。法国的弗朗索瓦一世亦曾被视为玛丽的订婚对象，因两人的婚事会促使两国结成友邦。后来签订的婚约亦保证玛丽会嫁予弗朗索瓦一世或他的次子，奥尔良公爵亨利。但后来亨利八世的首席顾问沃尔西成功透过其他方法保存两国的盟国关系，玛丽的政治婚姻亦失去其目的。婚事再次告吹。
由于凯瑟琳王后并未为亨利诞下他渴求的王子，两人的婚姻岌岌可危。亨利希望可结束这段婚姻，但得不到教宗克勉七世的同意。有人认为教宗的决定受凯瑟琳的外甥子，查理五世所左右。亨利坚称凯瑟琳早于16岁时已与他的兄长亚瑟结婚，因而已经不洁，但凯瑟琳与亚瑟是否有圆房一事备受争议。1533年，亨利八世秘密跟女侍官安妮·博林结婚。坎特伯里大主教托马斯·克兰麦随即宣布亨利与凯瑟琳的婚姻无效，和安妮的婚姻才是合法的。亨利八世因而与罗马天主教教廷决裂，自任为英国国教会（或称英国圣公会）首脑。因此，凯瑟琳被褫夺王后的位分，头衔变成威尔士王妃（即作为亚瑟遗孀的头衔），玛丽亦因此被贬为私生女，而公主的身份则转予她的同父异母妹妹，安妮的女儿，即未来的伊丽莎白一世。
玛丽被逐出宫廷，被迫遣散她的仆人。1533年12月，她甚至被命令成为伊丽莎白的女侍官。这段时期，玛丽的身体仍然抱恙。不过，玛丽一直坚持自己公主的身份，亦因而招惹父亲亨利和继母安妮的恼怒。这亦可能是玛丽一直不获准探望生母以及出席其葬礼的原因。由于她一直受到父亲和继母的冷酷对待，她一直没有善待童年至少女时期的伊丽莎白，她更为安妮被处死一事幸灾乐祸，并称安妮为女巫。虽然安妮死去，但玛丽和父亲亨利的关系并没有好转。玛丽尝试透过承认父亲英国国教会最高领袖的地位以取悦他。由于玛丽否定罗马天主教教廷，她亦间接承认凯瑟琳与亨利八世的婚姻的不合法性，以及她私生女的身份。
1536年，安妮·博林被处斩后，伊丽莎白亦失去公主的名衔以及王位的继承权。安妮死后两星期，亨利八世旋即再婚，对象是一名名为珍·西摩的女侍官。珍为亨利诞下王子爱德华，即后来的爱德华六世，但珍却于产后不久死去。由于玛丽答允当爱德华的教母，并出席及协助主持珍的丧礼，亨利便重新赐她仆人及居住于皇宫内的权利作回报。
1543年，亨利八世与凯瑟琳·帕尔结婚，这是他第六位，亦是最后一位妻子。凯瑟琳成功修补王室成员间的关系。翌年，亨利透过第三次继承法案，重新赋予玛丽和伊丽莎白王位继承权，紧随爱德华王子之后。但两人仍然是法律上的私生女。
1547年，亨利八世去世，爱德华六世继位。由于当时爱德华年纪尚幼，政权落在以新教徒为多的摄政议会中，这些新教徒尝试使新教成为英格兰的国教。玛丽是一名虔诚的天主教徒，直至查理五世应她所求出手协助以前，她要求在她的小教堂内私下进行弥撒均不被允许。宗教的差异是玛丽和爱德华之间的争执源头。玛丽三十多岁时曾与爱德华及伊丽莎白出席聚会，被爱德华斥责她不尊重他的宗教法律。玛丽深感受辱，甚至因此掉泪。
1553年7月6日，爱德华六世死于结核病，年仅15岁。爱德华并不希望王位落入玛丽手中，深恐她将复辟天主教。因此他决定把玛丽从王位继承权的名单上剔除。但由于他不可能只夺去其中一位姊姊的继承权，所以连信奉新教的伊丽莎白也一并失去王位的继承权。值得注意的是，爱德华的这个举动违反了1544年的第三次继承法案。
爱德华六世和信奉新教的高层贵族也希望把王位传给亨利八世的妹妹，法国玛丽王后的新教徒外孙女简·格雷女勋爵。她在同年7月10日继位。然而，玛丽受到更多人的拥护，一因她母亲的悲惨命运，广受同情成为助力。另一方面，简·格雷的公公诺森伯兰公爵和他的支持者则兵败如山倒。简·格雷被推翻，被称为“九日女王”，玛丽则成了新女王。简·格雷和约翰·达德利则被囚于伦敦塔。达德利于不久后以高度叛国罪被处死。虽然玛丽深知简·格雷本无争夺王位之心，但后因新教势力蠢蠢欲动，企图再次拥立她为女王而迫不得以把琴处决。
1553年10月1日，玛丽正式加冕成为英格兰的女王，玛丽一世。
玛丽的事迹也是小说家手里的好材料。不少小说以玛丽为原型写作，最近出版的包括：玛格丽特·乔治《苏格兰玛丽女王和不列颠岛：长篇故事》和吉恩·布莱迪《通往佛斯里亨的王家路：苏格兰女王玛丽的故事》。在儿童文学方面，关于玛丽的小说包括《傻女王：苏格兰女王玛丽》和《学院派王家日记选》，由凯瑟琳拉斯基所做的：“苏格兰女王玛丽，没有土地的女王，法兰西和1553年”。还有《修道院院长》《女王越狱记》。总之，所有的巴结和吹捧的描写都非常肉麻。相当的肉麻，堪称肉麻的典范。
