【学习目标】
掌握建立离体培养体系的理论和方法。
能够建立离体培养体系。
任务一外植体选择与消毒
【任务目标】
1.能够根据需要选择合适的外植体。
2.掌握用药物处理外植体的方法。
【任务设置】
选择秋海棠、百合、仙客来、榆叶梅、香石竹、草莓等植株的外植体并对其进行消毒。
【相关知识】
植物离体培养体系建立的成败，除了与培养基、培养条件有关外，另一个重要因素就是外植体本身。外植体的选择是否适宜、处理方法是否得当，直接关系着培养的难易程度和培养方向。因此，掌握外植体的选择原则及其处理方法是十分重要的。
一、外植体的选择
从理论上讲，任何活的并含有完整细胞核的植物细胞都具有全能性，只要条件适宜，都能再生成完整植株，所以任何器官、组织、细胞和原生质体都能作为外植体。但实际上，不同品种、器官、组织之间的分化能力有巨大差异，对诱导条件的反应也不一致。因此，为保证离体培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（一）选择性状优良的母株
只有具有优良遗传性状的材料，才能繁殖出好苗。尤其是进行离体快繁，具有优良的种质和基因型、生长健壮、无病虫害的植株，其快繁后代才具有商品价值，而且这类植株的外植体代谢旺盛、再生能力强，培养后也非常容易成活。
（二）选择适宜的取材季节
对大多数植物而言，在开始生长或生长旺季采集的外植体往往具有较高的内源激素含量，不仅容易分化、成活率高，而且生长速度快、增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期再取外植体的话，则诱导培养表现迟钝或无反应。比如，苹果芽在春季取材成活率为60%，夏季取材下降到10%，而到冬季则低于10%；马铃薯的块茎在4月、12月取材有较高的分化能力，而在2～3月或5～11月取的话则很少有分化现象。
（三）选择合适的取材部位
植物组织培养的离体材料几乎包括了植物体的各个部位，如根尖、茎尖、茎段、花瓣、叶片、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。但是，植物的不同种类以及同种植物不同部位的外植体之间，对培养条件的反应是不一样的。比如百合科植物多以鳞茎作为外植体进行组培，但不同属的风信子比较容易形成再生小植株，而郁金香就比较困难。再如，同种百合不同部位的鳞茎其再生能力差别也很大，一般外层比内层、下段比中上段的再生能力强。因此，无论是在生产，还是在研究，都必须选取最易表达细胞全能性的部位，以利尽快成苗。
对大多数植物来讲，茎尖由于其形态已基本建成，不仅生长速度快、繁殖率高，而且遗传性稳定，也是获得脱毒苗的重要途径，因此它是植物组织培养中最常用的外植体。但茎尖往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了广泛的应用。叶片的来源非常丰富，而且新出的叶片携带杂菌较少，实验操作起来亦十分方便，故而得到普遍利用。新梢的节间部是大部分果树和花卉等植物良好的组织培养材料，由于该部位消毒容易，而且脱分化和再分化能力均较强，因此是常用的外植体材料。花药和花粉培养已成为育种和获得脱毒苗（如草莓）的重要途径之一，此外还可根据实际需要，采用根、花瓣、鳞茎等部位来进行组织培养。
总之，在确定取材部位时，一方面要考虑外植体的来源是否有保证、是否容易成苗；另一方面要考虑外植体经脱分化产生愈伤组织后是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。对于培养困难但来源充足的植物，最好比较各部位的诱导及分化能力，方能做到保质保量。
（四）切取适合的大小
外植体的大小，应根据培养目的而定。比如，如果以茎尖为外植体进行脱毒培养，那么茎尖应取0.2～0.3mm或更小；如果是进行快繁，那么外植体宜大不宜小。但这里需要把握一个度，即外植体过大，则消毒难以彻底，而过小则培养难以成活。
一般来说，外植体的取材大小为0.5～1.0cm。具体地说，叶片、花瓣等以5mm×5mm为宜，茎段应带1～2个节，茎尖带1～2个叶原基、大小以0.2～0.5mm为宜。
（五）选择适当的生理状态和发育年龄
同一植株上的不同器官具有不同的生理状态和发育年龄，而同种器官的不同部位亦是如此。一般情况下，代谢越旺盛、生长年限越短的组织或器官具有较高的形态发生能力，组织培养也越易成功。比如，对草本植物来说，使用顶芽往往比侧芽更容易培养，这与顶芽生长较为旺盛有关；同样对木本植物来说，幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条也往往比树龄大的更容易获得培养成功。
（六）外植体来源要丰富
为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。因此，就需要外植体材料来源丰富并容易获得。
（七）外植体要易于消毒
在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，以降低初代培养的污染率。一般植物的地上部比地下部消毒容易；一年生组织比多年生组织消毒容易；幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易等。
二、外植体采集注意事项
植物离体培养的第一步是获得健康的无菌体系，而外植体是引入污染的首要来源。除了对外植体进行必要的消毒之外，注重取材前的栽培管理，保持外界环境清洁，尽可能减少对材料的污染，同时尽量使其正常生长发育，也是一项重要的降低污染率的措施。因此，采集外植体时应注意以下几个方面。
（一）避免连作苗
对于取地下球茎、鳞茎等作为外植体的植物，往往携带土传病害，而连作这种耕种方式恰好为病原菌的生存和繁殖提供了丰富的营养和寄主，从而使有益微生物的活动受到抑制，而病害加重，所以应避免选取连作植物。
（二）基质的选择和处理
若条件允许，可采用蛭石、珍珠岩、泥炭等基质进行无土栽培。在栽种前用药物或高温蒸汽对基质进行消毒灭菌，可大大减少培养材料的带菌量。
（三）细致施肥
基肥可以适当施些腐熟的有机肥，而追肥则尽可能使用无机肥料，以保证田间的清洁度，从而减少病菌活动的机会。施用有机肥时要注意，应在取材前1～2个月进行，并且不能浇泼到植株上。
（四）加强病虫害防治
搞好田地清洁、及时做好病虫防治等工作，能够确保外植体植株的健壮生长，特别是临近取材期，更要抓紧做好病虫的防治工作。一般1～2周喷一次农药对主要危害病虫进行防治。
（五）保证生长环境良好
植物生长的场地要开阔、阳光充足、通风透气，为此可在播种期和定植期将栽植密度和株型给予调整。如能在温室栽培则更理想，可比在田间栽培减少杂菌污染的机会。最好是在能控制光照、温度等环境条件的人工气候室内栽培，这样可以人工创造植物生长发育的最佳条件。
（六）避免阴雨天采取外植体
在晴天采集外植体可比阴雨天减少携带杂菌的机会，而且晴天下午采取的外植体要比早晨采的污染少，这是因为植物材料经日晒后部分细菌或真菌被杀死。
（七）提高无菌材料的获得率
虽然室内栽植可以减少植株污染的几率，但有些大型植物由于受到空间的限制不便或不能移栽于室内，这时可在田间对其枝条套上塑料袋，避免灰尘和病虫侵染。待植物材料长出新枝条后，再进行采集，这样可以大大增加无菌材料的获得率。
（八）打破休眠
一般来说，外植体应选择植物体生长旺盛的部位，但由于受到生长季等因素的影响，采取处于休眠状态的外植体也未尝不可，只不过需采用一定的方法打破休眠。比如，将休眠期带腋芽的枝条采回室内，经清洗、喷洒杀菌剂、插入含少量GA3或无机盐的溶液中浸泡、加温、水培等处理后，打破休眠，使其萌发新枝，然后将其嫩茎作为外植体进行组织培养。
三、外植体消毒药品
采好的外植体需要经过消毒才能接种到培养基中。选择消毒剂的标准是：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物细胞，也不会影响外植体的生长和分化，还容易被无菌水冲洗掉，没有残毒存留或自行分解、挥发。
四、外植体处理方法
外植体的处理方法分为以下三种。
（一）一般消毒法
第一步，对外植体进行修整，去掉不需要的部分，然后用流水冲冼干净。
第二步，用70%～75%的酒精浸润外植体30s左右。
第三步，用另一种消毒剂浸泡外植体，同时不断晃动消毒容器以使外植体与消毒剂充分接触，也可加入几滴土温-20，来增强消毒效果。
第四步，用无菌水冲洗外植体3～5次，以除去消毒剂。
（二）多次消毒法
第一步，对外植体进行预处理，即修整和清洗，去除特别容易污染的部分。
第二步，将外植体浸入1%次氯酸钠溶液中30min，然后用无菌水漂洗3次。
第三步，将外植体封闭于无菌培养皿中保温过夜。
第四步，次日用2%次氯酸钠溶液浸泡外植体30min，然后用无菌水漂洗3次。
（三）多种药液交替浸泡法
第一步，对外植体进行预处理，去除特别容易污染的部分。
第二步，将外植体放入70%～75%的酒精中数秒。
第三步，将外植体在500倍杀藻铵（洁尔灭，一种商品消毒剂）稀释液中浸泡5min。
第四步，将外植体浸泡在加入了几滴吐温-20的5%～10%次氯酸钠溶液中15～30min。
第五步，用无菌水冲洗外植体5次。
【任务实施】
一、外植体采集
（一）秋海棠采集直径达2～3cm的新生嫩叶作为外植体。
（二）百合采集生长健壮、开花性状良好的种球，将其鳞茎作为外植体。但在消毒前，需将鳞茎在4～5℃的低温下处理6～8周。
（三）仙客来采集已成熟但未脱落的种子作为外植体。
（四）榆叶梅在无病虫害的优良品种单株上，采集生长健壮的当年生枝条，取其带有饱满而未萌发芽的茎段作为外植体。这里需注意，因枝条顶部和基部的侧芽萌发能力较差，因此取中上部带有芽的茎段效果最好。
（五）香石竹选取生长健壮的植株茎尖作为外植体。
（六）草莓现蕾时，取直径约4mm花蕾，经镜检选择处于单核靠边期的花药作为外植体。具体的镜检方法是从每个花蕾中取花药1～2枚置于载玻片上，加碘液1～2d，用镊子压碎花药，剔除碎片，加上盖玻片，在显微镜下观察。由于处于单核期的花粉尚未积累淀粉，故被碘染成黄色，并且多数花粉细胞只有一个核，被挤向一侧，即为单核靠边期。从形态上来看，处于单核靠边期的草莓花蕾未开放，花萼略长于花冠或花冠刚露出，花冠白色或淡绿色且不松动，花药微黄而充实。将这些花蕾用湿润纱布包好放入塑料袋中，扎好口袋，置4～5℃低温下处理3d再进行消毒处理。
二、外植体消毒
（一）秋海棠叶片无菌水冲洗3遍，75%酒精（或加吐温-80）漂洗15s，无菌水冲洗5遍，10%次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲洗5遍。
（二）百合鳞茎洗衣粉常规清洗，剥去鳞茎外皮及外部2～3层鳞片，切去少许顶部及基部，75%酒精浸泡30～60s，0.1%升汞处理15～20min，2%次氯酸钠处理10～15min，无菌水洗3～4次。
（三）仙客来种子流水冲洗10min，75%酒精漂洗20s，10%次氯酸钠浸泡30min或0.1%升汞浸泡10min，无菌水冲洗5遍。
（四）榆叶梅茎段饱和漂白粉溶液浸泡15～20min或0.1%升汞（加吐温-20）处理8～12min，无菌水冲洗5～8次，无菌纱布吸干表面水分。
（五）香石竹茎尖自来水常规清洗，无菌纱布吸干水分，70%酒精漂洗30～60s，0.1%升汞（加入适量吐温-20）处理6～10min，无菌水冲洗8～10次。
（六）草莓花药70%酒精漂洗10～15s，无菌水冲洗1次，2%次氯酸钠浸泡5～8min，无菌水冲洗3～5次。
【任务考核】
对每位同学的操作过程进行考核。
【知识拓展】
一、外植体消毒药剂
下面对一些常用的外植体消毒药剂的理化性质做简略介绍。
（一）70%～75%酒精
酒精具有很强的穿透力和杀菌力，通常外植体浸入15～30s即可起到消毒作用。由于酒精对细胞的杀伤力比较强，故使用时间不能过长。有时为了提高酒精的杀菌效果，可加入0.1%的酸溶液或碱溶液，因为H+和OH-能够改变细胞所带电荷的性质，增加膜透性，从而提高酒精的杀菌效果。但是由于酒精浸泡外植体的时间不宜过长，一般达不到彻底消毒的要求，所以必须结合使用其他消毒剂。同时，酒精可促进其他消毒剂的渗透作用，从而提高杀菌效果。
（二）次氯酸钙（漂白粉）
该试剂的使用浓度一般为9%～10%，而市售漂白粉的纯度较低，需要用其饱和溶液来消毒。次氯酸钙的分子式是Ca（ClO）2，吸潮后会失去有效杀菌成分氯气，而且氯气失去得越多，杀菌能力就越低。因此，次氯酸钙必须密封贮存以防潮解，并随配随用。次氯酸钙对植物杀伤力较小，并易被无菌水冲洗掉。但因其杀菌力较弱，故消毒时间较长，通常10min以上。
