第四节 各级医院细胞病理学工作室间质评评审细则
细胞病理学的制片技术除了传统涂片、细胞离心（Cytospin）制片、组织压片、印片等技术外，近些年还产生了液基膜式薄层细胞制片、液基沉淀式薄层细胞制片等新技术，这些液基薄片技术大大提高了细胞学制片质量，提高了宫颈癌筛查阳性率和诊断的准确性，目前已经成为理想的宫颈癌筛查方法。
在对制片技术进行革新的同时，一些先进的诊断技术也不断应用到诊断细胞学的临床实践中，极大地提高了细胞病理学的诊断水平。下面将对细胞病理学诊断新技术进行简要介绍。
一、免疫细胞化学
随着细胞学的发展，免疫细胞化学技术在细胞学领域的应用得以进一步普及，为诊断提供了更多的信息，有助于解决细胞学疑难病例的鉴别难题。此外大量预后指标的应用还可预示肿瘤的生物学行为和临床处理及治疗反应。目前采用的ICC方法大多可用于完整细胞涂片或细胞蜡块（CellBlock）切片。免疫细胞化学技术的原理及方法类似于常规组织切片上的免疫组织化学（IHC）技术，在此不做赘述，可参阅常规组织病理规范相关内容。下面仅就细胞病理学应用中的特殊要求和注意事项加以介绍，供工作中借鉴。
（一）细胞标本的制备
临床常见的细胞学标本主要来自宫颈、浆膜腔、口腔、食道、泌尿系统等处的脱落细胞和细针吸取细胞两大类。细胞学标本的制备方法主要有以下三种：直接涂片法、细胞离心（Cytospin）制片和液基制片法，这三种方法制备的细胞片均可用于免疫细胞化学。
随着各实验室液基薄片技术的广泛应用，液基薄层细胞涂片也越来越多的被应用于ICC。利用液基薄片进行ICC染色相比直接涂片和离心涂片效果更为理想。主要有：①大大减少血细胞、蛋白黏液及细胞碎片，减少可能出现的背景着色。②极少蛋白黏液附着，避免可能阻碍抗体进入细胞而造成的假阴性。③涂片中极少产生大细胞团，避免致密细胞团可能包裹免疫试剂而导致假阳性。④液基薄片制作简单，细胞量较少时也可进行制片，并且保存液中的细胞可较长时间保存。⑤液基薄片进行ICC时，使用的抗体浓度可较其他涂片稍低。
细胞蜡块就是将细胞标本通过离心或直接收集聚拢，可用蛋清或琼脂包裹后进行固定，以后的步骤与常规普通外检小标本相同。细胞蜡块含有非常丰富的细胞数，可切取数张至数十张切片。与完整细胞ICC相比，细胞蜡块方法更具有稳定性，抗体浓度和阳性对照等均与常规免疫组化相同，所以较其他的细胞涂片有明显优势。但是当标本中细胞量较少时，则无法进行细胞蜡块的制作。
（二）标本满意度
标本满意度是细胞学样本必须符合的基本要求。当细胞数太少时，细胞学医生很难得出肯定的结论。ICC染色样本的评价可借鉴TBS系统来对标本满意度的评估。对于细胞数较少的样本通常可采用常规染色后的细胞涂片作原位ICC。研究表明，在常规染色后的玻片上重新进行ICC染色，无论是否经过脱色过程，抗体标记结果相同，常用的抗体如CAM5.2、AE1／AE3、K803、CD20、CD45RO等均可用于这种已经染过色的玻片。
其次，同一细胞涂片上亦可进行两种抗体的标记，如当一种抗体标记阴性时，可用另一种抗体重新进行标记。或在细胞涂片上进行细胞转移的方法：先将细胞溶于一种溶剂，这种溶剂可以使细胞薄片从玻片上脱离，然后将细胞片分为几部分，附着于不同的玻片分别进行抗体标记。这样做的前提是必须保证每一份细胞涂片上都应含有目标细胞。
（三）固定
ICC染色固定的目的不仅是使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。固定剂的选择需根据不同的抗原和标本反复试验，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同抗原的固定。
ICC最常用的固定液是冷丙酮（4℃）和85%酒精。Leong推荐先用0.1%的福尔马林‐生理盐水固定，然后用85%的酒精固定10min，后一步可使细胞形态更加典型。在标记细胞核抗原时，Bibbo主张用85%酒精固定72h以上，但大部分抗原在甲醛固定的标本中免疫组化的结果更好。具体应用时可用0.1%的甲醛盐或10%的福尔马林固定。
细胞涂片涂好后应立即放入固定液（如果涂片中有较多液体可待涂片潮干后固定），涂片过度干燥容易造成假阳性染色。固定后的涂片如果不能及时进行ICC，可干燥后置于密闭切片盒中于－20℃保存。
（四）抗原修复和细胞穿透
经冷丙酮和85%酒精固定的细胞涂片，一般情况下可不经抗原修复直接进行ICC。对于某些核抗原的标记，如TTF‐1、Ki‐67、P16等，可选用热修复。另外脱落细胞表面常有较厚的糖蛋白附着，影响抗体进入细胞内，如果ICC标记效果不佳，可于染色前用Triton X‐100或Tween20处理涂片，以增加细胞膜对抗体的通透性。
（五）对照
为了证实细胞内显示的反应产物是否为特异性，对标记结果做出正确判定，对于每个样本都必须有阴性和阳性对照。除细胞蜡块可采用组织样本作为对照，阳性涂片可选用手术切除组织的针吸标本或细胞印片。但最佳对照方法还是根据抗体的特性，选择同一涂片中的自身对照即已知的其他细胞作为阴性或阳性对照。
（六）预防脱片
ICC过程中，由于反复换液冲洗，细胞涂片很容易脱片，因此必须使用多聚赖氨酸或APES等黏附剂预先处理的玻片（使用Thin Prep液基薄片时，用厂家提供的玻片即可）。细胞涂片不易过厚，涂片固定后可自然干燥半小时以上或60℃烤片半小时，以减少脱片。另外，缓冲液冲洗要更加轻柔，抗体反应过程在室温或4℃冰箱中进行，都可减少细胞脱片。
（七）避免非特异性染色
红细胞、白细胞及黏液成分均含有内源性过氧化物酶，能使显色剂DAB还原产生棕色反应物，造成非特异性染色使背景加深。因此，制备细胞涂片时应尽量收集有效细胞成分，减少红细胞、白细胞和黏液。例如，血性浆膜腔积液标本，离心后一定要取上清和血性沉淀之间的细胞层进行涂片，染色中可加3%过氧化氢的前处理。DAB显色时，在显微镜下观察显色，及时中止显色反应，并将多余的DAB冲洗干净，都有利于降低染色背景。
（八）免疫细胞化学标记结果的判断及其局限性
对于细胞病理学医生来讲，最重要的是要充分观察标本的常规染色，在此基础上做出初步判断，并确定进行抗体标记的细胞涂片中含有需要鉴别的异常细胞。与判断组织样本抗体标记结果一样，细胞涂片抗体结果的判断需紧密结合形态学观察，在不了解患者临床情况或对细胞形态学没有充分观察的情况下，仅凭抗体标记的结果不能得出任何结论，只有三者紧密结合，才能取得满意的结果。
抗体的种类繁多，可分为单克隆抗体和多克隆抗体两大类。各抗体的特异性和敏感性不同，其染色结果在很大程度上依赖于标本的固定及抗体标记技术成功与否。由于每种肿瘤均会出现多种抗体的阳性表达，在抗体的应用中，除非标本本身含阴性和阳性对照，否则都应设置阴性和阳性的外部对照。任何抗体的标记中都存在不均匀着色的情况，在对抗体标记做阴性或阳性的判断时，应对着色的肿瘤细胞数、阳性部位、背景染色情况、正常细胞的染色情况等进行综合判断。
假阳性结果的出现是多种原因的综合作用所致。首先，要正确区分阳性表达的细胞究竟是肿瘤细胞还是正常细胞，特别是在肿瘤细胞较少的情况下，不要将两者混淆。其次，细胞保存不当或坏死细胞以及在抗体标记过程中细胞涂片的干燥均可能导致假阳性结果。由于抗体的特异性往往比我们预期的低，在判断标记结果时，要对着色部位和背景的着色等做综合判断。第三，内源性生物素和过氧化物酶未被充分阻断而着色也是假阳性的原因之一。
假阴性结果的出现同样是多种因素综合作用的结果，标本固定不好导致抗原损失或隐蔽是常见的原因。Dabbs认为在酒精固定的标本中，S‐100或GCDFP‐15不着色。另外，抗体的浓度也非常重要，浓度过高或过低会出现假阳性或假阴性的结果。
二、核酸原位杂交技术
杂交的技术原理是核酸碱基互补，指DNA互补链、DNA与RNA或RNA互补链间发生杂交。原位杂交是互补碱基序列形成氢键的过程，构成稳定的复合体或杂交体（hybrid），主要工具是标记的特定序列探针。探针种类主要有四类：双链DNA、单链DNA、反义RNA和自动化合成的寡核苷酸探针，它们各有其本身的应用特点。双链DNA探针储存稳定；单链DNA探针多用于mRNA原位杂交；反义RNA探针制作流程短，制作效率高，但必须注意保存，防止探针降解；而寡核苷酸探针，DNA序列短，自动化合成简便，常采用多探针鸡尾酒式组合应用。目前应用的探针标记物多是非放射性核位素，如生物素、地高辛、碱性磷酸酶和荧光素等。在标记探针杂交的基础上，可进一步采用信号放大系统以增加敏感性。掌握免疫细胞化学操作者，不难掌握原位杂交技术，只是起始步以杂交反应代替抗原抗体反应。
免疫细胞化学与原位杂交在应用上可以相互补充。在下列情况：①不具备好的、可用的抗体；②抗体显色时背景高度着色；③细胞内蛋白分泌，但细胞内不储存；④细胞内所检测的核酸多于表达的蛋白质选择原位杂交检测。原位杂交一般比免疫细胞化学显示更具特异性和敏感性。特别是1888年以来，原位杂交技术获得各种DNA修复（微波、酶消化、热修复等）和显色放大系统的支持，极大地增加了敏感性，达到检测出低拷贝的目的。
原位杂交的杂交形式主要有三类：①DNA原位杂交，在细胞和组织水平上，多用于感染因子的检测，如人乳头状瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒（HBV）、巨细胞病毒（Cy to megalo virus，CMV）、幽门螺杆菌（HP）等。②荧光原位杂交（Fluorescence ISH，FISH），多用于细胞遗传性疾病，在间期核和染色体水平上分析染色体异常如三体病、基因扩增、基因易位。③RNA原位杂交，主要用于RNA病毒［如丙型肝炎病毒（HCV）］和基因表达水平的检测，如肿瘤的某种生物标志物以及病原微生物基因表达的RNA，EB病毒编码的小RNA。
在感染性疾病、细胞遗传性疾病和肿瘤三大类疾病中，都有应用原位杂交技术的成功经验。以下列举几项检测：
（一）人类乳头状瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）
HPV是国际公认的第一类致癌物，特别被列为女性高发肿瘤宫颈癌的重要病因，现已发现HPV有200多种亚型，HPV可感染各种器官，其中30余种亚型或更多与生殖道感染有关。从HPV与癌发生的相关性，HPV可分为高危型和低危型。通常可以采用HPV广谱探针原位杂交（涵盖20余种常见亚型）作为病原诊断的初筛，也可以分别采用高危型（HPVl6／18）或低危型（HPV6／11）以明确诊断。
HPV原位杂交所采用的探针通常是双链DNA，将HPV原位杂交检测与液基细胞学结合起来可以应用于宫颈癌筛查和预防。30岁以上妇女如果细胞学阴性，HPV也阴性，3年内无需复查；如果细胞学阴性，高危型HPV阳性，应建议6～12个月复查；如复查HPV仍阳性，再考虑阴道镜和活体组织检查；如果细胞学检查发现未确定的鳞状上皮异型性（Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance），但原位杂交HPV检测阴性，此时可暂不采取阴道镜下活检，而继续细胞学追踪，因而减少尚不必要的阴道镜和活体组织检查，充分发挥无创伤的细胞学筛查作用。HPV原位杂交用于组织学切片，除了明确病原诊断，并可证实HPV已侵入上皮细胞。在上皮细胞内，HPV主要定位于细胞核内，也可见于细胞质。HPV在核内有两种原位杂交信号存在模式，根据Cooper等的研究，一般认为细胞核中颗粒状显色，代表HPV整合入细胞基因组中，整合型病毒阳性信号比较弱，呈点状或多个点；而弥漫的核着色，信号强，代表游离型病毒信号。上述两种HPV信号模式，可以在同一地区出现，有时低拷贝的游离型采用高敏感的原位杂交显示试剂，也可能出现与整合型类似的点状信号，判读时应注意分析。除宫颈、生殖道癌外，在HPV感染高发地区，发现与HPV感染相关的食管癌、口腔白斑，也曾见过食管下段的多发乳头状赘生物的患者，HPV检测强阳性。
适用于临床筛查HPV感染及对HPV进行基因分型，还有一些通过FDA认证的其他相关杂交技术：杂交捕获（hybrid capture，HC）技术及HybriMax为代表的导流杂交基因芯片技术。
