基因工程的核心是基因重组，而前面所得到的外源DNA均需要在体外实现DNA的重组。所谓DNA体外重组，是将目的基因（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。
DNA体外重组技术，主要是依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。在连接反应中，正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例，是能否获得高产量的重组体转化子的一个重要因素。本章主要讲述DNA与载体的体外连接重组以及重组体的转化鉴定。
7.1目的基因与质粒载体的连接
依据外源DNA（目的基因）片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质，可选择采用黏性末端的连接法和平末端连接法。
7.1.1黏性末端的DNA片段的连接
具黏性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。一般选用一种对载体DNA只具有唯一限制酶切位点的限制酶做位点特异切割。经此酶消化之后就会形成全长的具黏性末端的线性DNA分子。再将外源DNA大片段也用同一种限制酶做同样的消化，随后把这两种经过酶切消化的外源DNA和载体DNA混合起来，并加入DNA连接酶，由于它们具有同样的黏性末端，因此能够退火形成双链结合体。但是，由限制酶产生的具有相同黏性末端的载体DNA分子，要防止载体发生自身环化现象。避免自身环化的有效方法是用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP或CIP）预先处理线性的载体DNA分子，去除线状载体DNA两末端的5′磷酸基团。这样，在连接反应中，载体DNA的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接了。
当质粒载体和外源DNA片段用同样的限制酶切割时，由此引导的外源DNA片段的插入，可以有两种彼此相反的取向，这对于基因克隆是很不利的。当用两种不同的限制酶（如用BamH Ⅰ和H ind Ⅲ）消化外源DNA时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA片段，此种片段可采用所谓的定向克隆（directional cloning）法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用BamH Ⅰ和H ind Ⅲ进行消化而产生相匹配粘端的载体当中。
7.1.2平末端连接法
如果两个DNA片段的末端是平末端的，那么不管是用限制酶切割后产生的，还是用其他方法产生的，都同样可以进行连接，但是只能用T4噬菌体DNA连接酶。带有平末端的外源DNA片段与载体进行连接反应时，要求极高浓度的T4噬菌体DNA连接酶、高浓度的平末端外源DNA和质粒DNA、低浓度（0.5mmol/L）的ATP、不存在亚精胺一类的多胺。
如果待连接的两种DNA片段中，一种DNA片段具有平末端，而另一DNA片段具有黏性末端时，就无法用DNA连接酶催化连接；或者虽然待连接的两种DNA片段都具有黏性末端，但不是互补黏性末端，同样不能用DNA连接酶催化连接。在这两种情况下，前者可以先用S1核酸酶除去DNA片段的黏性末端，修饰成平末端的片段；后者可以先用S1核酸酶将两种DNA片段都修饰成平末端片段，然后再按平末端连接方法进行连接。
有时，需要将平末端DNA分子处理成带有黏性末端的分子，再进行连接。这些处理方法大致有：
1.同聚物加尾法
同聚物加尾法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶可催化dNTP 加到单链或双链DNA3′羟基端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。
2.加人工接头连接法
人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体，而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。人工接头的5′末端先用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，再通过T4DNA连接酶的作用使人工接头与待克隆的平末端DNA片段连接起来。接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子，使两者都产生出彼此互补的黏性末端，这样便可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
使用人工接头的克隆需进行两次连接反应，第一次反应是先使平端的双链人工接头与平端的目的DNA相连，使人工接头聚合于目的片段的两末端，然后经加热灭活连接酶并用适当的限制酶切割以产生粘端，再通过柱层析除去剩余的接头。第二次连接反应则是将加上接头的目的DNA片段与带有匹配粘端的载体DNA相连接。
采用双人工接头连接技术，还可实现外源DNA片段的定向克隆，同时避免了无外源DNA片段插入的线性载体分子自身再连接的问题，该技术特别适用于具多克隆位点的克隆载体。加人工接头连接法的缺点是，如果待克隆DNA片段或基因内部也含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，那么在酶切消化人工接头产生黏性末端的同时，也会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后续的操作造成麻烦。
3.加DNA衔接物连接法
DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整末端（与双链目的DNA平端连接），另一头带有某种限制酶的黏性末端（与载体的相应粘端连接）。
它在与双链目的DNA连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体DNA进行连接反应。
在实际连接反应中，由于处在同一反应体系中的各个DNA衔接物分子的黏性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成二聚体分子，带有两个DNA衔接物的目的DNA分子自身也可形成共价闭环分子或线状嵌合分子，因此对DNA衔接物末端的化学结构必须进行修饰与改造，使之无法发生彼此间的配对连接。
7.2重组克隆载体引入受体细胞
只有将携带某一目的基因的重组克隆载体DNA引入适当的受体（宿主）细胞中，进行增殖并获得预期的表达，才算实现了某一目的基因的克隆。
受体细胞是指在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞。作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：①具有接受外源DNA的能力，即能发展成为感受态细胞。②一般应为限制缺陷型，即外源DNA进入宿主细胞后不至于被限制酶所降解或被修饰酶修饰。③一般应为DNA重组缺陷型。重组缺陷型可保持外源DNA在宿主细胞中的完整性。④不适于在人体内或在非培养条件下生存。⑤具有安全性，它的DNA不易转移。
现有的重组克隆载体受体系统主要有大肠杆菌系统、酵母系统、枯草杆菌系统。正在研究开发的受体系统还有棒状杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、放线菌、耐高温菌等系统。这些微生物必须经人工改造才能作为基因工程的受体细胞，改造的目的在于提高细胞的转化效率，保证一定的安全性。
将外源重组体分子导入受体细胞的途径包括转化、转染、转导、显微注射、电穿孔等多种不同的方式。这些途径将随载体种类和受体系统的不同而异。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。
把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化（transformation）。将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程则称为转染（transfection）。从本质上讲，转化和转染两者并没有什么根本的差别。若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导（transduction），通常称为感染。它比转染的克隆形成效率要高出几个数量级。
1.重组体DNA分子的转化或转染
重组DNA转化到大肠杆菌细胞中的效率与其感受态有关。感受态就是细菌吸收转化因子（DNA）的生理状态。细菌在低温下经CaCl2溶液处理，细菌细胞膨胀成球形，提高了膜的通透性，转化混合物中的DNA，形成抗DNase 的羧基钙磷酸复合物，黏附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA，如λ噬菌体DNA或质粒DNA等。
2.高压电穿孔法（电转化法）
该法既可用于将DNA导入真核细胞，也可用于转化细菌。通过优化各个参数（包括电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等），每微克DNA可得到109～1010个转化体，是用化学方法制备感受态细胞转化率的10～20倍。
制备用于电转化法的细胞要比制备感受态细胞容易得多，其大致过程是：将培养至对数中期的细菌加以冷却、离心，用低盐缓冲液洗涤并回收细胞。进行电转化时，将细胞悬液与重组质粒DNA混合（20～40μL），移入一个预冷的样品槽内，在0～4℃下用较高的场强进行电转化。
3.重组λ噬菌体DNA的体外包装和转导
应用DNA重组技术，把带有目的基因的外源DNA片段插入到λ载体之后，还要设法将这些重组体分子导入宿主细胞。最简单的是采用转染方法，即用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入宿主细胞内。但是，λ重组体DNA分子的转染作用是一种低效的过程，即使是用未经任何基因操作的新鲜制备的λDNA，其转染效率也仅在105～106之间。
由于λ重组体DNA分子转染作用的低效性，显然难以满足一般的实验要求。因此，根据噬菌体能够将其DNA分子有效地注入到宿主细胞内部的这种特性，建立了另一种将外源重组DNA分子导入宿主细胞的方法，即体外包装噬菌体颗粒的转导技术。它是先将重组的λ噬菌体DNA或重组的黏粒载体DNA，在体外包装成具有感染能力的成熟的λ噬菌体颗粒，然后使这些带有目的基因序列的重组体DNA，能够按照正常的噬菌体感染过程导入宿主细胞，结果λ重组体DNA分子的转染效率可提高到107左右。
体外包装即是将含有目的基因的重组λ噬菌体DNA与含有包装所需各种蛋白成分的包装提取物混合于试管中一起温育，在菌体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒，再由这些活性的重组噬菌体感染合适的宿主菌，并将重组DNA导入宿主菌中。
7.3重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
现在已建立了多种可以将重组克隆载体DNA导入哺乳动物培养细胞的转染技术，其中最为常用的是磷酸钙共沉淀转染和DEAE 葡聚糖介导的转染，此外，还有利用聚季铵盐（polybrene）的DNA转染、利用原生质体融合的DNA转染和电穿孔法DNA转染等。
7.3.1磷酸钙和DNA共沉淀物转染法
由磷酸钙介导的转染是最为常用的方法，有人认为重组DNA是通过内吞作用进入细胞质，然后进入细胞核而实现转染的，这种转染法十分有效，一次可有多达20%的培养细胞得到转染。由于重组载体以磷酸钙DNA共沉淀物的形式出现，培养细胞摄取DNA的能力将显着增强。
7.3.2DEAE 葡聚糖介导转染法
该法可广泛用于转染带病毒序列的质粒。有人认为DEAE 葡聚糖这一聚合物可能与DNA结合从而抑制核酸酶的作用，或者与细胞结合从而促进DNA的内吞作用。该转染法通常只用于目的基因的瞬时表达，它在BSC1、CV1和COS 等细胞系表达行之有效。进行转染时所需的DNA量较上法要少一些，在105个猴源细胞上采用100～200ng超螺旋质粒DNA，其转化效率最高，所用DEAE 葡聚糖的浓度及细胞暴露于DNA/DEAE 葡聚糖混合液中的时间是两个影响本法效率的重要参数。可采用两种技术方案：较高浓度（1mg/mL）和较短作用时间（0.5～1.5h），或较低浓度（250μg/mL）和较长作用时间（8h）。
7.3.3利用聚季铵盐的DNA转染法
对于用其他方法相对较难转染的细胞系，可用聚阳离子聚季铵盐（polybrene）来促进低小分子质粒DNA进行有效而稳定的转染，如用于CHO 细胞时，可以获得约15倍于磷酸钙DNA共沉淀法的转染细胞。
7.3.4电穿孔法DNA转染
利用脉冲电场将DNA导入培养细胞的方法称为电穿孔法，该法对于用其他转染技术不能奏效的细胞系仍适用，已用于将重组DNA导入多种动物细胞和植物细胞，也用于细菌细胞。现有各种商品化的电穿孔装置，可按厂商提供的说明进行操作。注意，电穿孔法转染的效率受以下因素的影响：外加电场的强度，电脉冲的长度、温度，DNA的构象和浓度以及培养液的离子成分等。
7.4重组子的筛选与鉴定
在DNA体外重组实验中，将外源目的DNA片段与载体DNA进行连接，形成重组子，然后通过转化、转染或转导等适合的途径导入宿主细胞中，最终获得带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在。从理论上讲，这个过程本身并不是非常复杂的，然而在重组DNA的实际操作中并非经重组与转化后的所有宿主细胞都是包含外源DNA片段的转化子。目的DNA与载体DNA正确连接，并重组导入细胞的频率往往极低。
