这种方法的基本操作程序为：将初筛的重组DNA提取出来，用合适的限制性内切酶将其切割成不同的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳，将这些DNA片段按相对分子质量大小分离成不同区带，然后将含DNA片段的琼脂糖凝胶变性，并利用毛细虹吸作用由转移缓冲液带动其中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素膜或其他固相支持物上，而各DNA片段的相对位置保持不变。当然也可以利用电场作用进行电转；还可以利用真空抽虑作用进行真空转移。最后将此膜同标记的核酸探针进行分子杂交。如果被检测DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检测DNA的条带部位结合成双链的杂交分子，并通过放射自显影显示出黑色条带来。
由于Southern印迹杂交中滤膜是从凝胶上原位印迹而来，因而能够显示出与探针杂交的DNA片段的大小。因此，Southern杂交能测出基因重排，而斑点杂交则不能。
7.7免疫化学检测法
当待检测的重组克隆既无任何可供选择的遗传表型标记，又没有合适的核酸探针用于杂交检测时，那么采用免疫化学检测法来筛选重组子将是一种重要的手段。免疫化学检测法是一种间接的筛选方法，它利用特异性抗体与外源DNA编码的抗原的相互作用进行筛选，是一种特异性强、灵敏度高的检测方法。只要有一个克隆的目的基因能够在受体细胞中表达，合成外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法来检测重组体克隆。因为这种方法是通过检测受体细胞中是否有外源目标基因的蛋白产物来筛选与鉴定重组子的，所以使用免疫化学检测法的前提是插入的外源基因必须在受体细胞内表达，并且具有目的蛋白质的抗体。常见的免疫化学检测法主要有放射性抗体检测法（radioactive antibody test）和免疫沉淀检测法（immunopreci pitationtest）。
7.7.1放射性抗体检测法
1978年，Broome和Gilbert设计了一种免疫筛选方法，现在已发展成为常规的放射性抗体测定法之一。该方法的基本原理及操作步骤是：首先把转化的菌落涂布在琼脂培养基平板上，同时制备影印的复制平板，备用。接着把原平板放置在氯仿蒸汽中处理，使细菌菌落裂解，阳性菌落释放出外源DNA表达出的蛋白产物，即抗原蛋白质。将吸附有相应抗体的固体支持物聚乙烯薄膜轻轻地敷在先前裂解的菌落平板上，让聚乙烯薄膜与裂解的菌落相互接触。
这样，阳性菌落释放出的抗原蛋白将与聚乙烯薄膜上的抗体蛋白相互识别，发生免疫反应，形成抗原抗体复合物。然后将这种吸附有这种抗原抗体复合物的固体支持物聚乙烯薄膜取出来，与预先用放射性同位素125I标记好的第二种抗体放在一起进行温育，带有放射性标记的抗体与前面的抗原抗体复合物再次发生免疫反应，形成携带有同位素125I的新的复合物。最后经放射自显影，显示出抗原与125I标记的抗体结合的位置，并由此确定复制平板上能够合成抗原的菌落，即重组体菌落。
这种检测方法与菌落原位杂交检测方法有些类似，它们都需要将菌落原位转移到固相支持物上，都需要用放射性标记的探针来杂交筛选。但是菌落原位杂交检测中的固相支持物一般为硝酸纤维素膜，而放射性抗体检测法所用的固相支持物为聚乙烯薄膜；前者所用的探针为核酸，而后者所用的探针为蛋白；前者采用核酸互补配对的规则来进行核酸杂交，而后者却采用抗体抗原的免疫反应来进行蛋白质杂交。前者是直接用来检测目的基因的，而后者却是通过检测目的基因表达的蛋白产物来间接检测目的基因。
考虑到放射性抗体检测法存在对人体的辐射危害，近年来非放射性抗体检测法逐渐被广泛应用。非放射性抗体检测法的发展得益于非放射性标记物的发展与成功应用。例如，可以采用直接与辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）偶合的第二抗体，检测目的蛋白抗原抗体复合物。也可以采用与HRP 偶联的抗生素蛋白来检测与生物素偶联的第二抗体等。利用酶可催化特定的底物反应而呈现颜色变化，可以指示出含有目的基因的克隆位置。非放射性抗体检测法具有安全、半衰期短且易保存等特点，因此该检测方法是一类很有发展前途的检测方法。
7.7.2免疫沉淀检测法
免疫沉淀检测法是在平板培养基上直接进行免疫反应，以鉴定产生蛋白质的重组菌落。
具体操作方法是：将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心倾注到长有菌落的平板培养基上，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，菌落表面的细菌发生溶菌反应，逐步释放出细胞内部的蛋白质。
如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，在菌落周围出现一条由一种叫做沉淀素的抗体抗原沉淀物所形成的白色沉淀圈。这种方法简便且快速，但有报告称此法灵敏度低，易受干扰。
7.8核酸序列测序分析法
尽管经过上述各种方法可以对重组子进行筛选与鉴定，但是要真正对其进行最后鉴定仍需要采用核酸序列测序分析法。核酸序列测序分析法是指通过一定的方法确定DNA分子上的核苷酸排列顺序，也就是测定DNA分子的A、T、G、C 的排列顺序。测序的结果直接反映了转化子中有无目的基因的存在，同时也能直接看出目的基因的核酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化。如果克隆的DNA片段的序列是未知的，那么通过测序才能确知其序列结构、推测其功能，用于进一步的研究。因此，核酸序列测序分析是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。
目前，DNA序列测定方法主要有两种：一种是Sanger 发展的双脱氧链终止测序法，另一种是Maxam 与Gibert 建立的化学降解测序法。这两种方法对DNA测序的原理不相同，但都建立在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术之上，将差别仅有一个核苷酸的单链DNA区分开来，其分离长度可达300～500bp。随着DNA测序技术的不断发展和其重要性的日益提高，DNA序列分析已变得越来越简单快速，朝着自动化和商品化的方法发展，从而极大地提高了DNA序列分析的速度及准确性。
7.9报告基因检测法
作为报告基因必须具备以下条件：①不存在于正常受体细胞中；②较小，可构成嵌合基因；③能在转化体中高效表达；④具有相应的有效选择剂，或容易检测，并能定量分析。
报告基因通常是指用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因。理论上说，在有合适种类和浓度的选择剂存在时，存活的细胞或由之再生的植株均是转化了的，但是在培养过程中通过突变可产生抗性变异体，也有因产生生理抗性而逃脱选择的同时，转化植株通常是嵌合体，即混有未转化的细胞。因此，测定外源基因的表达，对于确证转化子显得十分重要。但有的外源基因的表达很难检测，只有通过检测与其构建在一起的报告基因表达。许多抗生素标记基因都可以作为报告基因，常用的如：
7.9.1新霉素磷酸转移酶基因
新霉素磷酸转移酶基因（Npt Ⅱ）又称为氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，是至今在植物遗传转化中运用最广泛的选择标记。Npt Ⅱ基因表达可使转化细胞对氨基葡萄糖苷类抗生素（如卡那霉素、庆大霉素、G418等）产生抗性。Npt Ⅱ基因最初是从细菌的转座子Tn5中分离得到，所编码的新霉素磷酸转移酶通过磷酸化使抗生素失活而发挥作用。Npt Ⅱ对茄科植物的转化选择特别有效，对豆科植物和单子叶植物效果不佳。
7.9.2双氢叶酸脱氢酶基因
氨甲喋呤钠是一种对植物细胞毒性极大的化合物，能强烈抑制双氢叶酸脱氢酶（DHFR）的活力。在一种该酶突变的鼠中，该酶与氨甲喋呤钠的亲和性降低了260倍，将该基因与35S启动子拼接后转入植物，可使矮牵牛、烟草、油菜等多种植物产生抗性。不过，也已发现在矮牵牛的某些品种中，利用该基因作为标记基因的转化频率不如使用Npt Ⅱ基因，这可能与氨甲喋呤的毒性太强有关。
7.9.3潮霉素磷酸转移酶基因
潮霉素（hygromycin）是一种对大多数植物有毒性的抗生素。把从细菌中分离到的潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因构建成能在植物细胞中表达的嵌合基因后导入植物，使其获得对潮霉素的抗性，因为该基因产物通过酶促磷酸化而使潮霉素失活。特别是对某些植物（如拟南芥）在用卡那霉素不能进行有效筛选时，通过导入此基因而使用潮霉素作为选择剂显得十分有用。对禾谷类作物用潮霉素作为选择剂比用卡那霉素更为有效。
7.9.4氯霉素乙酰转移酶基因
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因（cat）来自细菌转座子Tn9，它编码的氯霉素乙酰转移酶催化氯霉素形成3乙酰氯霉素、1乙酰氯霉素和1，3二乙酰氯霉素，而使抗生素失活。将cat基因构建成可在植物中表达的嵌合基因导入植物即可使转化细胞抗氯霉素。但在一些情况中，CAT 作为选择标记并不理想，实验的重复性也不很好。虽然如此，由于用14C 标记的氯霉素试验可通过放射自显影或直接测定放射强度，即可知cat 基因的表达活性，方法十分灵敏而简便，因此cat 基因同时也就成为一种常用的报告基因。值得注意的是，已在Brassica 属植物中发现有相当高的内源CAT 活性，同时在油菜和芥菜中还存在一种CAT 活性的抑制物，这使得测定油菜的转化细胞或转基因植株中的CAT 活性十分困难。
7.9.5冠瘿碱合成酶基因
冠瘿碱合成酶是位于T‐DNA上的基因所编码的一类与冠瘿碱（如章鱼碱、胭脂碱、农杆碱等）合成有关的酶，由于大多数植物中并不存在这类酶，这类基因在农杆菌中也不表达（因为它们的启动子是真核型的），故通过鉴定冠瘿碱的存在可以确定外源基因的表达。使用纸电泳方法测定章鱼碱和胭脂碱更为简便有效。
7.9.6β葡萄糖苷酸酶基因
β葡萄糖苷酸酶（GUS）基因是目前应用最广的报告基因之一。该基因由大肠杆菌中分离到，由Jefferson 最先应用于植物细胞转化。通过组织化学染色而定位，可观察不同器官和组织中GUS 的活性，也可通过荧光分光光度计进行定量测定。两者的反应底物分别为5溴4氯3吲哚β葡糖苷酸酯（X‐Gluc）和4甲基伞形花酮βD 葡糖苷酸酯（4MUG）。
X‐G1uc 使存在GUS 活性的细胞染成蓝色，而4MUG 在GUS 作用下形成4MU（4甲基伞形花酮），后者在365nm、455nm 光下激发荧光，在455nm 下检测，这一方法相当灵敏方便。
但是Hu 等（1990）对包括被子植物和裸子植物在内的共52种植物的内源GUS 活性进行了测定，发现对于所试的多种植物在营养生长阶段并没有GUS 活性，但在大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中却都可以测到明显的GUS 活性。随着种子的萌发，GUS 的活性逐渐消失。因此，在应用这一报告基因时，应排除假阳性存在的可能。另外，在一些植物（如烟草）中也可能存在干扰GUS 测定的物质。
7.9.7荧光素酶基因
目前用作报告基因的荧光素酶基因来源于细菌或萤火虫。在转基因植物或细胞、或提取物中，荧光素酶在存在Mg2＋和ATP 的条件下可氧化荧光素，在此过程中产生荧光，其强弱可用荧光计测定，在一定条件下，也可在暗处直接进行观察鉴定。
本章小结
DNA体外重组技术，主要依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。目的基因与质粒载体的两端如果是匹配的黏性末端，可直接连接。如果是平末端，需要将平末端DNA分子处理成带有黏性末端的分子，再进行连接。这些处理方法大致有：同聚物加尾法、加人工接头连接法、加DNA衔接物等。将外源重组体分子导入受体细胞的途径包括转化、转染、转导、显微注射、电穿孔等多种不同的方式。这些途径将随载体种类和受体系统的不同而异。
重组子的筛选与鉴定就是从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组子的菌落并鉴定重组子的技术方法。常用的重组子筛选与鉴定方法主要有遗传学检测法、物理检测法、核酸分子杂交检测法、免疫化学检测法与核酸序列测序分析法。这些方法是从不同的层次（DNA、RNA和蛋白质）与不同的角度（载体、受体细胞与外源目标DNA）来进行筛选与鉴定的。根据不同的克隆载体、外源目标DNA及受体细胞，其重组子的筛选与鉴定方法也各不相同，而且各具优缺点。筛选与鉴定方法的正确选择是保证结果准确性与有效性的重要前提。
思考题
1.什么是人工接头？ 如何利用它进行平末端DNA的连接？
2.重组子筛选与鉴定主要有哪些方法？ 其原理是什么？
3.以pBR322为例，论述重组体分子插入失活筛选方法。
4.如何利用β半乳糖苷酶对X‐gal 的呈色反应选择重组体分子？
5.一个携带有氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因的质粒仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoR Ⅰ消化。消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的E.coil菌株，试问：
（1）利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？
（2）怎样区分接受了插入酵母DNA的质粒的克隆？
6.菌落原位杂交、斑点印迹杂交和Southern印迹杂交各有何优点和缺点？
（叶子弘、赵彦宏）
