3.2.1λ噬菌体的生物学特性
λ噬菌体由一个包裹着DNA的正二十面体的蛋白质头部和一个中空管状的蛋白质尾部组成，属温和噬菌体。当它感染大肠杆菌时，尾部吸附在大肠杆菌细胞壁上，头部中的DNA经尾部注入到细菌细胞中，蛋白质外壳留在细菌细胞外面。噬菌体DNA进入细菌细胞内后，可有溶菌周期和溶原性周期两种生活周期。在溶菌周期中，λ噬菌体的DNA分子便可借助宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白合成，同时两者组装成完整的噬菌体颗粒，20min 后就可使宿主细胞发生裂解，释放出大约100个噬菌体颗粒。在溶原性周期中，λ噬菌体的DNA分子并不马上复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成一体，并随宿主染色体的复制而复制，随宿主的分裂繁殖而传给其子代细胞（图35）。但这种潜伏的λ噬菌体DNA在某种营养条件或环境条件胁迫下，可以从宿主染色体DNA上切割出来，并进入溶菌周期。
λ噬菌体基因组是一条线性双链DNA分子，大小为48502bp，其上有12个碱基的单链互补黏性末端，当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesive‐end site）。这是将λDNA包装到噬菌体颗粒中所必需的DNA序列。
λ噬菌体基因组分为3个区域：①左侧区，自基因A 到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。②中间区，介于基因J 与基因N 之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片段取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和一整合切割基因。③右侧区，位于N 基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。
在裂解周期的早期，环状的λDNA分子按θ 型进行双向复制，到了晚期，控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ 型转变成滚环型复制，合成出由一系列λDNA线性排列的多聚体分子。线性的λDNA多聚体分子不能被包装进头部，必须经过核酸酶的切割作用，从cos 位点将它分成单位长度的单体分子，才能够被包装起来。cos 位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。
在溶原性周期，λDNA稳定地整合到宿主染色体上并随之一起复制。在进行这种复制时，只有CI 基因得以表达，合成出一种可以使参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。
3.2.2常见的λ噬菌体载体的构建
野生型的λ噬菌体DNA基因组大而复杂，不适于直接用作基因克隆的载体，而且λ噬菌体外壳只能接纳一定长度（即相当于野生型λ基因组大小的75%～105%）的DNA分子。因此必须对野生型λDNA进行改造。
根据理想基因工程载体的条件，并针对野生型λ噬菌体作为基因工程载体的缺陷，对λDNA进行了以下几方面的改造：①切除掉λDNA的非必需区段，扩充λ噬菌体载体的克隆容量；②除去λDNA必需区段中的限制性核酸内切酶识别位点，在非必需区引入合适的限制性核酸内切酶位点；③引入适当的选择性标记以方便重组子的筛选；④通过在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生物学防护等。
早期构建的λ噬菌体载体有插入型和取代型两种不同的类型：只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体，称为插入型载体，如λgt10、λgt11、λBV2、λNM540、λNM1590、λNM607等。具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA区段可被外源DNA片段所取代，这类λ噬菌体派生载体称为取代型载体（或称置换型载体），如Charon4、Charon10、Charon35、λgtWES、λEMBL3等。这两种载体特点不同，用途也不尽相同。插入型载体只能承载较小的外源DNA片段，一般在10kb 以内，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆；对于取代型载体，除去中间填充片段，其左右两臂通过融合所形成的基因组如果太短，就无法包装成有侵染力的噬菌体；只有当一定大小的外源DNA片段插入之后，才能包装成有侵染力的噬菌体，并形成噬菌斑。由此可见，这种载体对重组噬菌体有正向选择作用。
取代型载体可承载20kb 左右的外源DNA片段，常用来克隆高等真核生物的染色体DNA。随着多克隆位点技术的应用，现在常规使用的λ噬菌体载体都带有多克隆位点，其中许多既可用作插入型又可用作取代型。
3.2.3常见的λ噬菌体载体
在λ噬菌体载体的非必需区段插入L acZ′基因，其中带有多克隆位点，如λgt11、λgt18～23等，它们在生色底物（Xgal）和诱导物（IPTG）存在时，与相应的Lac－宿主通过α互补作用在平板上可形成深蓝色噬菌斑。如果β半乳糖苷酶基因被外源DNA片段插入失活，所产生的重组噬菌体丧失α互补能力，则在含有X gal 和IPTG 的平板上形成无色噬菌斑。因此，对于这类λ噬菌体载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。这类载体有λgt11、λgt18～23、Charon2等，都含有lacZ′基因，其上具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点，可用组织化学法筛选重组体。
噬菌体434是λ噬菌体家族的成员之一，它的免疫区段（imm434）具有EcoR Ⅰ和H ind Ⅲ两种限制性核酸内切酶的单切位点，当由这些位点插入外源DNA片段时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破坏。因此，凡带有外源DNA片段的重组体只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本则形成混浊的噬菌斑，所以不同的噬菌斑形态可作为筛选重组体的标志。科学工作者通过噬菌体杂交的办法，已经将imm434免疫区段导入λ噬菌体基因组，构建成许多免疫功能失活的插入型载体。这类常用的载体有λgt10、λNM1149及Charon6、Charon7等，可根据噬菌斑的形态筛选重组体。
Charon 系列取代型载体专门设计用来克隆大片段DNA，常用的有Charon32～35、Charon40、Charon21A 等。Charon34的中间填充片段为16.4kb 的大肠杆菌DNA的BamH Ⅰ片段，Charon35的中间填充片段为15.6kb 的大肠杆菌DNA的BamH Ⅰ片段，它们在填充片段的两侧都有一个反向的多克隆位点。
λEMBL 系列取代型载体也是用来克隆DNA大片段的，常用的载体有λEMBL3、λEMBL4、λEMBL3A 等。λEMBL4的中间填充片段为13.2kb，其两侧为限制性核酸内切酶的单切位点。λEMBL3A 是在λEMBL3的基础上使A 基因发生琥珀突变而构建的。
3.3单链DNA噬菌体载体
单链DNA噬菌体载体主要是由M13噬菌体构建发展起来的一类载体。它们具有其他载体所不具备的优越性：①它们不存在包装限制问题，已成功地包装了总长度为M13DNA6倍的DNA分子，能克隆较大的DNA片段。②可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子在基因定点突变、DNA序列测定、杂交探针制备中特别有用。③应用这类载体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入方向。④可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA，如同质粒一样，能在体外进行基因克隆操作。⑤其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。因此，它们在基因工程中具有特别重要的作用，越来越受到人们的重视。
3.3.1M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体含有一个6.4kb 的单链闭环DNA分子，外形呈丝状，大小为900nm×9nm，这条感染性的单链DNA称为M13噬菌体的正链DNA［（＋）DNA］。M13噬菌体基因组的90%以上是编码蛋白质基因，M13噬菌体并不像λ噬菌体那样存在插入外源DNA的非必需区域。
M13噬菌体在感染大肠杆菌时通过性纤毛进入宿主细胞内，故其只能感染大肠杆菌雄性菌株。M13噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生溶菌现象，感染的细胞能够继续生长和分裂，一般认为，M13噬菌体首先吸附在性纤毛的末端，然后外壳蛋白脱落，（＋）DNA在附于其上的基因Ⅲ编码蛋白的引导下，进入大肠杆菌细胞内。在宿主细胞内复制酶的作用下，以（＋）DNA为模板，合成其互补的（－）DNA，形成双链DNA，称为复制型DNA（replicationform DNA，RFDNA），它按θ形式进行DNA复制。当在宿主细胞内积累约200个RFDNA分子后，M13噬菌体的基因Ⅱ产物便在RFDNA的正链特定位点上作用，产生一个切口，正式开始M13基因组的复制。其基本特点是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以（－）DNA为模板按滚环方式合成（＋）DNA，复制叉每环绕负链整整一周时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切除下去，经环化后形成单位长度的M13噬菌体基因组DNA。这种滚环复制是不对称的，因为基因Ⅴ编码的单链特异结合蛋白，与（＋）DNA结合，阻断（－）DNA的合成。新产生的游离（＋）DNA按一种特异方式包装成噬菌体颗粒。这时与基因Ⅴ产物形成DNA蛋白质复合物的（＋）DNA转移到细胞膜上，同时基因Ⅴ蛋白从（＋）DNA上脱落下来，（ ＋）DNA从宿主细胞膜上溢出，并在此过程中被外壳蛋白质包装成噬菌体颗粒。这种包装方式不需要预先形成固定结构，被包装的单链DNA大小不像λ噬菌体那样有严格的限制，因此M13噬菌体载体具有较大克隆能力。
3.3.2常见的M13噬菌体载体
大多数M13噬菌体载体都是成对构建的，例如M13mp8／M13mp9、M13mp10／M13mp11、M13mp18／M13mp19等，它们之间的区别在于相同的多克隆位点取向相反。
M13mp1是构建的第一个M13噬菌体载体，随后构建的一系列M13载体都是在此基础上经改建派生出来的。例如M13mp2、M13mp3、M13mp7～11及M13mp18和M13mp19等，其中M13mp18和M13mp19是目前最常用的M13噬菌体载体。
M13mp8～11及M13mp18和M13mp19等的多克隆位点是非对称排列的，对某一限制性核酸内切酶只有单一酶切位点。因此，可用来克隆具有不同限制末端的外源DNA片段，而且克隆片段插入的方向是固定的。
M13噬菌体载体的主要用途：第一，可以制备单链DNA进行DNA序列分析，例如可以用一个引物（通用引物），从两个相反的方向，同时测定同一个外源DNA片段双链的核苷酸顺序，获得彼此重叠又相互印证的DNA序列结构资料。第二，可以制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。第三，可以在寡核苷酸介导的基因定点突变中用来制备含有目的基因的单链DNA模板。
M13噬菌体载体也存在不足，插入的外源DNA片段不稳定，片段越大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅1.5kb。理论上，M13噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的方向插入的。
3.4噬菌粒载体
噬菌粒载体（phagemid vector，phasmid vector）集质粒和丝状噬菌体载体的长处于一体，具有很大的优越性：①分子较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段。②由于它们既具有质粒的复制起始点，又具有M13噬菌体的复制起点，因此在宿主细胞内可按质粒双链DNA分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，复制按M13噬菌体的滚环复制模型进行复制，产生单链DNA分子。③具有多种功能，用一个噬菌粒载体可以进行多种多样的工作，例如，外源DNA片段的克隆、产生单链模板DNA用于基因定点突变、直接测定插入的外源DNA片段的序列、对外源基因进行体外转录和翻译等。
pUC118和pUC119噬菌粒载体是把含有M13噬菌体复制起点的476bp 长的片段分别插入到pUC18和pUC19质粒载体的N de Ⅰ位点上构建而成的。除了多克隆位点的取向相反外，两者的分子结构完全一样，都含有A mpr选择标记和乳糖操纵子的调控序列及α肽编码区，因此，可利用氨苄青霉素和组织化学法筛选重组子。此外，在多克隆位点的两侧具有T7噬菌体RNA聚合酶启动子，可进行体外转录。
