水分是蘑菇的重要组成成分，也是蘑菇生命中不可缺少的因素之一。双孢菇菌丝体含水量为70％～75％，子实体含水量在90%左右，其水分主要来自培养料、覆土以及空气中的水分。
培养料的含水量是影响栽培成败最重要的环境条件之一。由于秸秆有蜡质层保护，发酵前期吸水性差，所以培养料的水分应在建堆前、建堆及翻堆时分别加入，逐步调整含水量，在播种前含水量调整到65%左右。含水量低于50%，菌丝生长缓慢，菌丝纤细；高于70％，透气性弱，菌丝生长慢甚至不能生长，容易导致杂菌滋生，造成栽培失败。覆土的含水量依覆土材料不同而有较大差异。采用砂壤土作为覆土材料，菌丝体在覆土层中生长和原基形成阶段，含水量应在18％左右；在子实体直径达0.5厘米时，覆土层的含水量应在20％以上。如果用泥炭作为覆土材料，覆土的含水量应在30％左右。
菇房中空气相对湿度影响培养料和覆土的湿度以及双孢菇菌丝体和子实体的生长发育。在不同生长阶段，双孢菇对空气相对湿度的要求也不同。一般发菌阶段要求空气湿度在70％～75％，如果湿度偏低，会导致培养料和覆土层失水过多，影响菌丝生长；如果湿度偏高，会导致杂菌大面积发生。子实体分化和发育阶段空气湿度应提高到85％～90%。在出菇期空气湿度若低于70％，菌盖表面粗糙，产生鳞片，甚至发生龟裂，菇质较差；低于50％则停止出菇，原有的小菇蕾也会因干燥而枯萎死亡；如果湿度长期保持在90％以上，遇到持续高温和通风不良，极易发生锈斑病及其他子实体病害，甚至菇蕾大批死亡。
