二、外植体的再生途径
外植体再生途径一般可分为无菌短枝型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型和原球茎发生型等五种类型。
（一）无菌短枝型
将顶芽、侧芽或带有腋芽的茎段接种到培养基上进行培养，逐渐形成一个微型的多枝多芽的小灌丛结构，继代时将该小灌丛结构反复切段转接，从而迅速获得较多嫩茎（在特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛）的增殖方式称为无菌短枝型，也叫做微型扦插或无菌短枝扦插。将这些嫩茎转接到生根培养基上，即可培养出完整的植株。
这种外植体再生途径适用于顶端优势明显，或枝条生长迅速，或对组培苗质量要求较高的植物，如月季、葡萄、矮牵牛、茶花、菊花等。由于不经过愈伤组织诱导阶段，故最能保持原有品种的优良特性。实践中多选取植株上部3～4节的茎段或顶芽、侧芽等。
（二）丛生芽增殖型
将茎尖或带有腋芽的茎段接种到培养基上进行培养，逐渐形成一团丛生芽的结构，继代时将该丛生芽结构反复分割成单芽转接，从而迅速获得较多新丛生芽的增殖方式称为丛生芽增殖型。这种外植体再生途径可实现快速、大量繁殖的目的。
（三）器官发生型
该再生途径分为三种类型：一是外植体经脱分化形成愈伤组织，在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构形成完整植株；二是外植体经脱分化形成愈伤组织，在愈伤组织中先出芽后长根，再发育成完整植株；三是外植体经脱分化形成愈伤组织，在愈伤组织中先长根后出芽，再得到完整植株。但在培养中如果先形成根，往往会抑制芽的形成。相反，若先形成芽，则以后较易产生根，进而形成完整植株。影响器官发生的因素主要有以下三点。
1.外植体
从理论上讲，所有的植物都具有被诱导产生愈伤组织的潜力，但不同植物被诱导的难易程度不同。一般来说，被子植物比苔藓、蕨类、裸子植物诱导容易；草本植物比木本植物诱导容易；幼年材料比老熟材料诱导容易等。即使是同一株植物，不同的部位被诱导的难易程度也不同。比如，油菜的花比叶、根等更易于诱导；水稻和小麦幼穗的诱导率比其他器官高等。
2.培养基
培养基的类型、成分、激素及比例等，都对愈伤组织的诱导有影响。主要表现为四点：
第一，高无机盐浓度对愈伤组织的诱导和生长有利。比如，无机盐浓度较高的MS、B5等培养基均可用于愈伤组织的诱导。
第二，生长素与细胞分裂素的浓度和比例是控制愈伤组织生长和分化的决定因素。一般来说，高浓度的生长素和低浓度的细胞分裂素有利于愈伤组织的诱导和生长。生长素中，以2，4-D诱导愈伤组织效果最好，但使用浓度过高，则会抑制不定芽的分化；细胞分裂素中，KT和6-BA都能广泛地诱导芽的形成，但6-BA比KT的效果好。
第三，糖、维生素和甘氨酸等有机成分，可以满足愈伤组织生长和分化的营养要求。此外，糖类物质还能起到维持培养基渗透压的作用。
第四，液体培养基比固体培养基更能促进愈伤组织生长和分化。
3.培养环境
离体培养条件下，除了一小部分植物愈伤组织的诱导与分化需要暗环境外，绝大多数都需要一定的光照，这是因为光照对芽的形成、根的发生、枝的分化和胚状体的形成等均具有促进作用。温度也是影响植物愈伤组织诱导与分化的重要因素。一般来说，23～27℃条件下都能较好地促进芽和根的分化，而有些植物则需要在一定的昼夜温差条件下培养，才能更好地发生器官分化。
（四）胚状体发生型
胚状体类似于合子胚但又有所不同，虽然它也经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚的发育过程，形成类似胚胎的结构，但它是由体细胞发育而来的。胚状体既可由愈伤组织表面或悬浮培养的细胞发生，也可由外植体表面已分化的细胞产生。它是植物离体无性繁殖最快捷的途径，也是制备人工种子常用的方法。但有的胚状体具有变异性，所以需要经过试验和检测后才能在生产上大量应用。影响胚状体发生的因素主要有以下两点。
1.植物激素
在愈伤组织的产生和增殖过程中，2，4-D等生长素有时会使愈伤组织的若干部位分化形成胚性细胞团，只有降低或者完全去除这些生长素时，才能发育成胚状体，如金鱼草、矮牵牛。有些植物在只有细胞分裂素的培养基上也能诱导胚状体，如大麦、檀香。大多数植物在生长素与细胞分裂素结合的培养基上才能诱导出胚状体，如山茶、花叶芋。
2.含氮化合物
含氮化合物中对胚状体的形成起主要作用的是NH4+。如果愈伤组织是在含有KNO3和NH4Cl培养基上建立起来的，那么无论随后的分化培养基是否含有NH4Cl，愈伤组织都能形成胚状体。另外，水解酪蛋白、谷氨酰胺和丙氨酸等对胚状体的发生也有一定的作用。
由于胚状体发生型和器官发生型均可起源于愈伤组织，因此这两种再生植株常常混淆，现将二者主要区别罗列如下。
（五）原球茎发生型
原球茎是一种类胚组织，可以看作是呈珠粒状短缩的，由胚性细胞组成的类似嫩茎的器官。一些兰科植物的茎尖或侧芽经过培养可直接诱导产生原球茎，继而分化成植株，也可以通过原球茎切割或针刺损伤等手段进行增殖培养。
五种外植体再生途径起源不同、特点各异，现将其总结在表格中，方便比较和理解。
三、离体培养环境
接种完成后的外植体要放入培养室中培养。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是温度、光照、湿度、氧气、pH和极性等。
（一）温度
离体培养中对温度的调控比较重要，这是因为不同植物所需的生长最适温度不同。大多数植物的生长最适温度在23～32℃之间，而低于15℃或高于35℃，都将对生长不利。一般培养室所用的温度是25±2℃。一些观赏植物组织培养适温如下。
有时温度也会影响到形态发生的类型。例如，蝴蝶兰花梗芽培养，在25℃时表现为上部的芽发育出生殖茎，而下部的芽产生营养茎，而在28℃时所有的芽都产生营养茎。
（二）光照
植物组织培养中光照也是重要影响因子之一，主要表现在光周期、光强和光质三个方面。
光周期影响植物的生长，也影响花的形成建成。一般保证12～16h/d的光照就能满足大多数植物生长和分化的要求。比如，天竺葵愈伤组织诱导芽形成，以15～16h/d的光照，芽产生最多。还有，16h/d的光照对烟草表皮薄层切块诱导花的形成是最适合的。
光强的要求并不十分严格。有实验证明，1/1000lx的弱光即可对根的形成起诱导作用，300～500lx的光强基本可满足多数植物的要求。通常在初代和继代培养阶段，大约需500～1000lx，而到壮苗生根阶段，则可提高到3000～5000lx甚至10000lx，这主要是为了提高随后出瓶种植到土壤或其他介质中的成活率。此外，光强对成苗数目、苗的健壮程度也有许多益处。
光质对愈伤组织诱导、细胞增殖以及器官分化都有明显的影响。比如，百合珠芽在红光下培养8周后分化出愈伤组织，但在蓝光下几周就出现愈伤组织；而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，且形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细，红光下出苗少。由此可见，不同的植物对光质的反应有所差异。
（三）湿度
湿度的影响主要体现在两个方面：一是培养容器内的湿度条件，主要受培养基水分含量和封口材料的影响，可通过加减琼脂用量和使用通气性好的封口材料来调节；二是培养环境的湿度条件，湿度过高或过低都是不利的，过高易导致污染，而过低会造成培养基失水而干枯，一般要求环境的相对湿度为50%～80%，若室内过潮可用除湿机降湿，过干则可喷水来增湿。
（四）氧气
氧气是离体组织生长的重要因子，也体现在两个方面：一是培养容器内的通气状况，主要受到封口材料的影响，可选用附有滤气膜的封口材料或是棉塞，但棉塞易使培养基干燥，夏季容易引起污染，也可采用液体振荡方法培养，而固体培养基可加入活性碳来增加通气度；二是培养环境的通气状况，一般要求培养室定期换气，以改善通气状况，但注意换气的空气质量。
（五）pH值
培养基的pH值会影响培养物对营养物质的吸收与其生长速度。不同植物对环境最适pH值的要求是不同的。大多数植物的最适pH值在5.0～6.5之间，一般要求培养基的pH值为5.8。但也有例外，如蝴蝶兰培养时，pH值为5.3；杜鹃培养时，pH值仅为4.0。pH值过高，不但培养基变硬、阻碍培养物对水分的吸收，还影响离子的解离释放；pH值过低，则容易导致琼脂水解，培养基不能凝固。
（六）极性
植物的极性现象有着广泛的作用和影响。如唐菖蒲、朱顶红、石刁柏等花序轴切段，以及杜鹃茎的切段培养中，当外植体以形态学的基部放在培养基上时，从远离基部的表面上，诱导出茎的数目较多，而当把外植体的形态学基部背离培养基方向放置时，虽然也能产生茎，但数量较少，茎诱导被延迟。
【任务实施】
一、基本培养基筛选
（一）配制基本培养基，每种培养基各35瓶，每瓶约30mL。
（二）采集和处理非洲紫罗兰的外植体叶片，然后接种在培养基中培养。
（三）观察外植体诱导情况。
（四）根据观察和统计结果，筛选出最佳基本培养基。
二、生长调节剂筛选
（一）使用筛选出的基本培养基，在此基础上添加生长调节剂，每种培养基各配制35瓶，每瓶约30mL。
（二）采集和处理非洲紫罗兰的外植体叶片，然后接种在培养基中培养。
（三）观察外植体诱导情况。
（四）分析外植体诱导情况，筛选出最佳生长调节剂浓度。
【知识拓展】
离体材料培养过程中，由于外植体、培养基和培养条件等因素的影响，常常会出现褐变、玻璃化和黄化等问题。
一、褐变
褐变是指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐而死亡的现象。
（一）褐变的原因
褐变的发生与外植体中所含的酚类化合物和多酚氧化酶有直接关系。酚类化合物在完整的植物组织和细胞中，与多酚氧化酶是分隔存在的，当外植体被切割后，切口附近细胞的完整结构被打破，使得酚类化合物与多酚氧化酶接触，被迅速氧化成褐色的醌类物质，醌类物质又在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终衰老死亡。
在植物组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。因此，能否有效控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
（二）影响褐变的因素
1.植物材料
（1）种类和品种
植物的不同种类和品种其褐变发生频率及严重程度有很大差异，这是由于不同植物体内所含的单宁及其他酚类化合物的含量不同而造成的。一般木本植物中酚类化合物的含量比草本植物高，因此木本植物更易发生褐变。比如核桃中单宁含量很高，极易褐变，接种初期就会发生褐变，继而在形成愈伤组织后还会因褐变而死亡。所以，在组织培养中，应考虑对植物的种类和品种进行筛选，力争采用不褐变或褐变程度轻的外植体来进行培养。
（2）年龄
外植体老化程度越高，木质素含量就越高，也就越容易发生褐变。而幼龄材料一般都具有比成龄材料褐变轻的趋势。
（3）取材部位
幼嫩茎尖较其他部位褐变程度轻，而木质化程度高的节段在经表面消毒处理后褐变现象加重。一些种类如蝴蝶兰、香蕉等随着培养时间的延长，褐变程度加剧，甚至超过一定时间不进行继代转接，褐变物质的积累还会引起培养材料死亡。
（4）取材时期
植物体内酚类化合物的含量和多酚氧化酶的活性呈现季节性变化。一般植物在生长旺季含有较多的酚类化合物，而且多酚氧化酶的活性也较强。有人认为取材时期比取材部位更加重要，如苹果和核桃，冬、春季取材褐变死亡率最低，但夏季取材就很容易褐变。
（5）外植体大小及切口
外植体越小，越易发生褐变，而相对较大的外植体则褐变较轻。比如，金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重，当茎尖长度在5mm～15mm时褐变较轻。
外植体的切口越大，酚类物质被氧化的面积也越大，褐变程度就会更严重。因此，为了减轻褐变，在切取外植体时，尽可能减小切面面积，并使伤口尽可能平整。此外，消毒剂也可使外植体受伤而引起褐变，如次氯酸钠能使不易发生褐变的植物发生褐变。
2.培养条件
（1）光照
光照过强，可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体褐变。这是因为氧化过程中许多反应受酶系统控制，而酶系统的活性又受光照影响。在苹果、桃等茎尖培养中，如果外植体取自田间自然光照下的枝条，接种后很容易褐变，若事先对其遮光处理，则可有效控制褐变。
（2）温度
温度对褐变的发生影响很大。低温能降低多酚氧化酶的活性，从而抑制酚类化合物被氧化，减轻褐变。有试验表明，卡特兰在15～25℃条件下培养比在25℃以上褐变程度轻。
3.培养基
（1）培养基状态
液体培养基可有效克服外植体褐变，这是因为在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。
