（2）无机盐
初代培养时，若培养基中无机盐浓度过高，会促使酚类化合物大量外溢，导致外植体褐变。原因是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与催化酚类化合物合成与氧化反应中酶类的组成成分或辅助因子。因此，如果无机盐浓度过高会提高这些酶的活性，酶又进一步促进酚类化合物的合成与氧化。
（3）植物生长调节物质
植物生长调节物质是影响褐变的主要原因。比如，细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，还能刺激多酚氧化酶的活性，从而产生褐变，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。而生长素如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。
（4）pH值
培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率，从而抑制褐变，而pH值升高则明显加重褐变。
4.转瓶周期
对于易褐变的材料，若接种后转瓶不及时，伤口周围积累的醌类物质逐渐增多，会加重褐变，以致培养材料全部死亡，而缩短转瓶周期则可有效减轻褐变。
（三）预防褐变的措施
1.外植体选择
多选择幼嫩、分生能力强且褐变程度轻的品种和部位作为外植体，如实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等，并加大接种数量。
2.外植体预处理
在接种前，对外植体进行20～40d遮光处理或暗培养，可减轻一定程度的褐变。或者将外植体洗净后，放置在4℃冰箱中低温处理12～14h，对于减轻褐变也有一定效果。
3.培养基调整和培养条件控制
降低培养基中无机盐的浓度、减少6-BA和KT的使用、采取液体培养，或者在不影响植物正常生长和分化的前提下，尽量降低温度、减少光照等措施均可有效降低褐变发生。
4.使用抗氧化剂
向培养基中添加抗氧化剂，或用抗氧化剂对外植体进行预处理或预培养，可预防醌类物质的形成，对易褐变材料的培养有很好的辅助作用。常用的抗氧化剂有抗坏血酸、牛血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、硫代硫酸钠、半胱氨酸及其盐酸盐、亚硫酸氢钠等。
5.缩短转瓶周期
对易发生褐变的植物，在外植体接种后1～2d即转移到新鲜培养基上，可减轻酚类物质对培养物的毒害作用，并且连续转移5～6次可基本解决外植体的褐变问题。
6.添加活性炭
向培养基中加入0.1%～2.5%的活性炭对吸附酚类化合物有明显效果。但要注意，用活性炭吸附有毒物质的同时，也会吸附培养基中的生长调节物质。
二、玻璃化
玻璃化苗与正常苗不同：叶片、嫩梢透明或半透明，呈水浸状，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低；由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽成活率低。
（一）玻璃化的原因
玻璃化是在培养材料芽分化启动后的生长过程中，体内碳、氮、水分代谢等发生生理性异常所引起的现象。其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产与积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化，其离体小苗也被称为玻璃（化）苗。
（二）影响玻璃化的因素
1.培养基
（1）琼脂浓度
琼脂浓度与组培苗玻璃化程度呈负相关，即琼脂浓度越高，组培苗的玻璃化程度越低。但随着琼脂浓度的增加，培养基逐渐硬化，这会影响养分的吸收。因此，琼脂的浓度需适当。
（2）无机盐
植物种类不同，对矿质离子的需求也就不同。如果培养基中离子种类及比例对该种植物不适宜，则玻璃苗出现的几率就会增加。特别是铵态氮，若浓度高则非常容易引起玻璃化。
（3）植物生长调节物质
高浓度的细胞分裂素容易诱发玻璃化现象。造成细胞分裂素浓度过高的原因有三点：一是培养基中一次加入过多的细胞分裂素；二是细胞分裂素与生长素的比例失调，细胞分裂素含量远高于生长素，故植物过多吸收细胞分裂素；三是细胞分裂素经多次继代培养引起累加效应，通常是继代次数越多，玻璃苗出现几率越大。
2.培养条件
（1）温度
温度升高时，组培苗生长速度加快，但温度若高到一定限度，则会对正常的生长和代谢产生不良影响，从而促进玻璃化的产生。变温培养时，忽高忽低的温度变化容易使水蒸汽在培养容器的内壁上形成小水滴，增加瓶内湿度，进而提高玻璃苗的发生几率。
（2）光照
增加光照强度可促进光合作用，提高碳水化合物的含量，使玻璃化的发生几率降低。当光照不足再加上高温时，极易引发组培苗过度生长，加速玻璃化发生。大多数植物在光照时间12～16h/d，光照强度1000～2000lx下都能正常生长。
（3）通风
培养容器内的湿度与通风密切相关。通过气体交换可使培养容器内的湿度降低，减少玻璃苗的发生；如果气体交换条件不利，则会导致容器内湿度和培养基含水量过高，加速苗的生长，使玻璃化发生几率升高。
（三）预防玻璃化的措施
1.适当提高培养基中琼脂浓度
适当提高培养基中琼脂浓度，可阻止植物过度吸水，从而降低玻璃化发生几率。比如，将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃苗完全消失。
2.适当控制培养基中无机成分
适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁含量，降低氮和氯比例，特别是降低铵态氮含量，选用低NH4+水平的培养基，可减少玻璃苗的发生几率。
3.适当降低细胞分裂素浓度
无论是减少培养基中一次加入细胞分裂素的含量，亦是提高生长素的比例，还是在继代培养时逐步减少细胞分裂素的含量，都可有效控制玻璃苗的发生。另外，适当添加低浓度的多效唑、矮壮素等生长抑制物质，也可降低玻璃苗的发生几率。
4.适宜的培养温度
适当的低温处理，能有效控制玻璃苗的发生。另外，热击处理也可预防玻璃化的发生，如用40℃热击处理瑞香愈伤组织培养物，可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。
5.增加自然光照，控制光照时间
玻璃苗在自然光下培养几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，这是因为自然光中的紫外线能促进组培苗成熟，加快木质化。但光照时间不宜太长，大多数植物以12～16h/d为宜，光照强度在1000～2000lx，就可满足植物生长的要求。
6.改善培养容器的通气状况
使用透气性好的封口材料，如牛皮纸、棉塞、封口膜等，加强气体交换，尽可能降低培养容器内的空气湿度，进而防止玻璃苗的发生。
7.向培养基中添加其他物质
向培养基中适当添加活性炭、间苯三酚、根皮苷、聚乙烯醇等物质，可有效减轻或控制玻璃化的发生。比如，活性炭可降低油菜玻璃苗的发生几率，聚乙稀醇可以防治苹果砧木玻璃化的发生。
8.控制继代次数
随着继代次数增加，离体材料中会逐渐积累过量的细胞分裂素，从而使玻璃化程度不断加重，而最初培养的几代继代苗中，玻璃化现象很少，这在香石竹、非洲菊等植物中均有报道。
三、黄化
黄化是指在组培过程中由于培养基成分、培养环境等因素引起的幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。
（一）黄化的原因
引起黄化的原因主要有七点：一是培养基中铁含量不足，各矿质营养不均衡；二是培养基中激素配比不当；三是培养基中糖用量不足或长时间不转瓶糖已耗尽；四是培养基的pH值变化过大；五是培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高；六是培养温度不适；七是光照不足。
（二）控制黄化的措施
首先，检查培养基的配制过程，保证培养基各个成分均正确添加，并调节到最适pH值；其次，调控培养室的温度、光照，并改善通气状况。
任务四继代培养与生根培养
【任务目标】
1.掌握继代培养与生根培养的理论和方法。
2.了解人工种子生产与应用。
3.能够对继代培养基和生根培养基进行筛选。
【任务设置】
对非洲紫罗兰进行继代培养与生根培养。
【相关知识】
一、继代培养
继代培养是指将初代培养诱导产生的培养物重新分割，转移到新鲜培养基上继续培养的过程。这是因为外植体生长一段时间后，培养基中的营养物质枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢废物，所以需要将这些培养体转移到新的培养基上继续培养，从而得到大量繁殖，故也称为增殖培养。根据转移的次数分别称为第1次继代培养、第2次继代培养……，继代培养的后代数量按几何级数增加。
（一）继代培养基
对于同一种植物来说，继代使用的培养基完全相同，只是需要根据不同的生长与分化阶段随时调整生长调节剂的用量。
（二）继代增殖方式
继代培养过程中，培养物的增殖方式主要有以下五种。
1.多节茎段增殖
是将顶芽或腋芽萌发形成的多节嫩枝，剪成带l～2枚叶片的单芽或多芽茎段，接种到继代培养基进行培养的方法。该方法培养过程简单，适用范围广，移栽容易成活，遗传性状稳定，如马铃薯、葡萄、刺槐、山芋等都可采用此种方式增殖。
2.丛生芽增殖
是将顶芽或腋芽萌发形成的丛生芽分割成单芽，接种到继代培养基进行培养的方法。由于单芽可再萌发形成丛生芽，被分割后能再次接种到继代培养基中，如此循环，可达到快速、大量繁殖的目的。该方法不经过愈伤组织的再生，故后代最能保持原品种的优良特性，而且成苗速度快，繁殖量大，适合于大规模的商业化生产。
3.不定芽增殖
是将能再生不定芽的器官或愈伤组织进行分割，接种到继代培养基进行培养的方法。该法的增殖率高于丛生芽方式，但其再生植株遗传稳定性较差，而且随着继代次数的增加，由愈伤组织形成再生植株的能力会下降，甚至完全消失。
4.胚状体增殖
是通过体细胞胚的发生来进行无性系大量繁殖的方法。其特点是成苗数量多、速度快、结构完整，因而是增殖系数最大的一种方式。当胚状体发育到适宜阶段时，可以用人工合成的营养物和保护物包裹起来，做成“人工种子”。但胚状体的发生和发育情况复杂，经此途径繁殖的植物种类，远没有丛生芽和不定芽涉及的广泛。
5.原球茎增殖
是将未转绿的原球茎进行切割或针刺损伤后接种到继代培养基来培养的方法。该法的增殖速度非常快。当原球茎培养一段时间后会逐渐转绿，并长出毛状假根，叶原基发育成幼叶。
一种植物的增殖方式不是固定不变的，有的植物可以通过多种方式进行无性扩繁。比如，葡萄可以利用多节茎段和丛生芽的方式进行繁殖；蝴蝶兰可以通过原球茎和丛生芽的方式进行繁殖等。在组培生产中，具体应用哪一种方式进行增殖，主要看它们的增殖系数、增殖周期、增殖后芽的稳定性以及生产操作适合性等因素而定。
（三）继代培养方法
继代培养方法分为两种，即固体培养和液体培养。有时候两种方法也结合使用。比如，将兰花初代培养得到的原球茎分切后进行振荡培养（22℃恒温，连续光照）即可获得大量的原球茎，然后再切成小块转入固体培养基中，就能得到大量小苗。
（四）影响继代培养的因素及解决措施
同初代培养一样，继代培养过程中也会遇到一些问题。
1.驯化现象
在植物组织培养的早期研究中发现，一些植物经长期继代培养后会发生一些变化，即在继代培养初始阶段需要添加生长调节物质的离体组织，随后加入少量或不加入生长调节物质就能生长，这种现象叫做驯化。比如，胡萝卜薄壁组织培养过程中，初代时必须加入IAA才能达到最大生长量，但经多次继代后，不加IAA也可达到同样的生长量。但并不是出现驯化现象就好，比如卡德利亚兰实生苗在长期加香蕉的培养基中继代，最后导致只长芽不长根，虽然芽的增值率很高，但芽又细又弱，这时重新添加生长素进行培养，几次继代即可长出较多的根。
2.形态发生能力的丧失
在长期继代培养过程中，材料自身内部要发生一系列的生理变化，除了前面讲的驯化现象外，还可能丧失形态发生能力。一般认为形态发生能力丧失的原因主要三个：一是愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就带进来的分生组织，当重复继代时会逐渐减少或丧失，这意味着不能再形成维管束，只能保持无组织的细胞团；二是可能与内源生长调节物质的减少或丧失有关；三是可能是细胞染色体出现畸变，数目增加或丢失。
3.其他因素
不同种类的植物，或同种植物不同的品种，或同一植物的不同器官和部位，它们的继代增殖能力是不相同的。一般是草本强于木本、被子植物强于裸子植物、年幼材料强于老年材料、刚分离组织强于已继代组织、胚强于营养体、芽强于胚状体和愈伤组织等。
培养基对继代培养也有影响。比如，在水仙鳞片基部再生子球的继代培养中，向培养基加入活性炭比不加，其再生子球数要高出一至几倍。还有，在MS培养基初次培养的桃茎尖，若转入同样的MS培养基则生长不良，而转入降低氨态氮和钙，增加硝态氮、镁和磷的培养基中则能继代繁殖。
