一等奖
沙漠微生物群落功能多样性的分析
王晓蕾1 张 琇2 周云锋 杜彦龙
摘 要：本文以宁夏沙坡头地区的沙漠微生物群落为研究对象，采用Biolog方法研究了已固定沙丘结皮（J1）及结皮下层（J2），半流动沙丘上层（L1）和下层（L2）中微生物群落的功能多样性。实验表明，J1的微生物群落活性最高，J2的微生物群落次之，再次为L2的微生物群落，最后为L1的微生物群落；J1，J2，L1和L2的微生物群落对羧酸类、聚合物类和氨基酸类碳源的利用表现一致，对糖类、胺/氨类和双亲化合物类碳源的利用表现不同；利用ECO板上31种碳源进行主成分分析，PC1，PC2和PC3特征值的贡献率分别为70.16%，19.23%，10.61%。结果表明：（1）经过固沙后的微生物群落活性明显高于半流动沙漠微生物群落的活性；（2）微生物群落结构上的差异致使其对6类碳源的利用方式不同；（3）主成分分析表明沙漠微生物群落对羧酸类、糖类和氨基酸类碳源的利用最高，主要利用碳源有22种。
关键词：Biolog；沙漠；微生物群落；功能多样性
由于沙漠微生物在沙漠生态系统的养分循环、系统稳定性以及沙漠固定化中都起到了非常重要的作用［1－4］，因此沙漠微生物是沙漠生态系统中极其重要和最为活跃的部分。沙漠微生物群落是由沙漠中多个微生物种群所组成的，它的群落结构和多样性可以敏感地反映沙漠的生态功能和沙漠的环境变化，同时它也是沙漠生态环境恢复的最先锋者。因此对沙漠微生物群落进行功能多样性研究可以为控制和优化沙漠微生物群落结构提供理论依据。沙坡头地区以沙漠生态治理闻名于世，目前对其水分、温度等物理性质研究较多，而对沙漠微生物活性和功能多样性的研究相对较少。目前研究微生物功能多样性的方法有Biolog-ECO技术［5］和微生物功能基因组学。前者可以简单而快速反映微生物群落活性水平以及微生物群落功能多样性［6－7］，后者的研究还正处于起步阶段。因此本实验采用Biolog-ECO技术，从沙漠微生物群落总活性，沙漠微生物群落对6类碳源的利用以及沙漠微生物群落主要利用碳源这三个方面来研究沙坡头地区沙漠微生物群落功能多样性［8－9］。本研究旨在为沙漠地区的退化治理提供微生物学依据，为沙漠地区生物防沙治沙工程奠定前期基础。
1. 实验材料与方法
1.1 实验地区概况及实验样品
本研究的实验地点位于宁夏回族自治区中卫市，腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区（104°57′E，37°27′N，海拔高度1310～1350m）。该地区属温带草原化荒漠；地貌为高大的格状沙丘，相对高度在15～20m之间；年均降水量为186.2mm，夏秋（5～9月）雨量占到全年降雨量的80.6%，年潜在蒸发量3007mm；年平均气温9.7℃，平均风速为2.8m/s，每年出现风沙天气122d。持水量仅3.34%～3.96%，凋萎含水率为0.6%，天然降水是沙漠水分的主要补给来源。
实验样品：选取沙坡头麦草方格固沙区人工固沙地，上层结皮部样品J1（0～1cm），结皮下层样品J2（10～12cm）和未固定流动沙沙漠上层样品L1（0～1cm）和下层样品L2（10～12cm），按S型路线选择10处，组成1个土样。样品除去动植物残体等杂质，四分法除去多余土样，装入密封袋，立即置于冰盒中运回实验，装入无菌小纸袋，于2h内放入4℃的低温冰箱中保存，并尽快进行Biolog分析。
1.2 实验材料与仪器
实验试剂：由Biolog公司生产，华粤企业集团有限公司提供。
主要仪器：Biolog MICROSOFT全自动微生物鉴定分型系统；Biolog电动八孔移液器；人工气候箱；超净工作台；摇床。
1.3 实验方法
微生物群落代谢活性和功能多样性采用Biolog-ECO方法进行测定。
操作步骤：称取相当于10g烘干沙土质量的4℃保存的沙土样品，置于250ml三角瓶中，加入90ml无菌生理盐水进行稀释。将此悬液在200r/min摇床上振荡分散30min，之后静置3~5min，再将Biolog-ECO板预热到30℃，使用八孔移液器将土悬稀释液按每孔150μL接种于ECO板的96孔中，对照孔内加入150μL无菌水。接种好的微平板放到铺有6层保持一定湿度纱布的塑料饭盒中，以防止微平板鉴定孔中的菌悬液挥发。同时塑料饭盒用保鲜膜包裹，保鲜膜上用无菌注射针头扎若干个小眼，以保证微生物的培养所需要的氧气。将ECO板放到30℃恒温避光培养6d，每隔24h用Biolog-ECO板读数器读取培养板在590nm波长时的吸光值。
1.4 数据分析
ECO板上的96个孔为3组重复，每32个孔为一组，除对照孔内加有无菌水以外，其他31孔分别是31种不同的碳源。这31种碳源分为6大类，Biolog-ECO板上31种碳源的分布和分类。微生物群落的代谢活性用每孔颜色平均变化率（average well color development，AWCD）来描述，计算公式如下：AWCD=∑（Ci－R）/31。公式中，Ci为各反应孔在590nm下的光密度值；R为ECO板对照孔A1的光密度值，Biolog生态板的碳源数目为31。Ci－R小于零的孔，计算中记为零，即：Ci－R≥0。采用培养96h的Biolog检测数据进行沙漠微生物群落的主成分分析［10］。所用数据用Microsoft Excel 2003和DPS软件系统处理，所有数据为3次重复的平均值。
2. 结果与讨论
2.1 不同沙漠微生物群落全部碳源利用的动力学特征
颜色平均变化率（AWCD）是反映微生物活性的一个重要指标，在一定程度上反映了土壤中微生物种群的数量和结构特征。AWCD值越大，表明微生物密度越大、活性越高；反之，微生物密度越小，活性越低。
由图1可以看出，在培养初期（0~24h），AWCD值很小，说明24h内碳源基本未被利用，样品微生物活性均相对较低；温育24h后J1，J2，L1，L2的AWCD值均开始升高；J1的AWCD值随着培养时间的延长呈现逐渐增加的趋势；而J2的AWCD值则随着培养时间的延长，呈现出稳定的趋势；在培养至72h之前，L1的AWCD值略高于L2的AWCD值，而在培养了72h以后，L1的AWCD值的增长趋势趋于稳定，L2的AWCD值却开始有较为明显的上升趋势。总体表现为J1＞J2＞L2＞L1。沙漠微生物群落代谢的AWCD值随时间变化曲线存在较明显的适应期、对数期和稳定期等阶段。可能由于监测时间不是足够长，衰亡期表现不明显。
2.2 沙漠微生物对不同类型碳源的利用强度
Biolog-ECO微平板的碳源包括羧酸类、聚合物类、糖类、双亲化合物、氨基酸和氨/胺类。沙漠微生物群落对单一种类碳源利用的平均吸光值随培养时间的变化（如图2-2所示）。不同沙漠样品中，微生物群落对羧酸类、聚合物类和氨基酸类碳源的利用表现一致：固沙结皮>；固沙下层>；流沙下层>；流沙上层；对糖类的利用表现为：J1>；L2>；J2>；L1；对胺/氨类碳源的利用表现为：J1>；L1>；J2>；L2；对双亲化合物类碳源的利用表现为：J1>；L1>；L2>；J2。沙漠微生物群落对6类碳源的利用方式的不同，可能是由于微生物群落中存在的微生物种类结构不同所致。这反映了沙漠微生物在数量和群落结构上的差异。
c 微生物群落对氨基酸类碳源利用的AWCD d 微生物群落对糖类碳源利用的AWCD
2.3 沙漠微生物群落多样性的主成分分析
主成分分析（PCA）是把多个因素化为少数几个综合因素的一种统计分析，可以将不同沙漠微生物群落对31种碳源利用的多元向量变换为互不相关的6类碳源主元向量空间中，用点的位置直观地反映出沙漠微生物群落功能多样性变化，用于解释微生物群落对碳源利用的多样性。采用培养至96h的实验数据进行主成分分析。数据矩阵包括4行代表4个实验样品，31列代表生态板上分布的31种不同的碳源物质。结果表明，一共提取了3种主成分，累计贡献率达100%，包含了全部变异信息。其中第1主成分（PC1）、第2主成分（PC2）和第3主成分（PC3）分别占总贡献率的70.16%，19.23%，10.61%。利用第1、2主成分将微生物群落划分为3个功能（如图2-3所示）类群，J1为一类，J2和L1为同一类，L2为一类。说明J1微生物群落生理活性有了较大提升，J1和L1微生物群落活性随环境变化趋于缓慢上升，L2微生物群落生理活性相对比较低。
影响第1主成分（PC1）的碳源是D-半乳糖酸γ-内酯、L-精氨酸、丙酮酸甲酯、D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺酸、吐温40、2-羟基苯甲酸、吐温80、L-苯丙氨酸、D-甘露醇、4-羟基苯甲酸、L-丝氨酸、N-乙酰-D葡萄糖胺、肝糖、D-葡糖胺酸、衣康酸、甘氨酰-L-谷氨酸、1-磷酸葡萄糖、α-丁酮酸、D，L-α-磷酸甘油、D-苹果酸、腐胺；影响第2主成分（PC2）的主要碳源是β-甲基-D-葡萄糖苷；影响第3主成分（PC3）的主要碳源是D-木糖、苯乙胺。I-赤藓糖醇对第2和第3主成分均有影响；L-苯丙氨酸和α-环式糊精对第1和第3主成分均有影响；其他碳源则是不被利用。
第1主成分（PC1）利用氨基酸类有6种，糖类有3种，羧酸类有8种，胺类有1种，双亲化合物类有2种，聚合物有4种；第2主成分利用糖类有2种；第3主成分利用氨基酸类有1种，糖类有2种，胺类有1种，聚合物类有1种。对主成分起分异作用的主要碳源类别分别是羧酸类、糖类和氨基酸类碳源，说明这4种微生物群落利用碳源的效率存在差异，利用的主要碳源种类是8种羧酸类化合物、7种糖类和7种氨基酸类，共22种碳源。
3. 结论
早期对沙坡头地区沙漠的研究主要集中在土壤微生物学特性以及理化性质上［11-14］，近几年来又研究了沙坡头人工固沙植被土壤水分空间异质性，沙坡头生物结皮发育特征及其对地表蒸发影响以及对土壤水文过程的调控作用［15-18］，并且对该地区的苔藓植物区系及其繁殖和生长特性进行了研究［19-20］。本项目是在前辈对沙坡头地区研究的基础上，通过Biolog-ECO板对该地区固沙结皮和结皮下层，流沙上层和流沙下层中的微生物群落的生物活性和功能多样性进行了比较研究，结果显示，在气候条件基本一致的前提下，已进行固沙的沙漠微生物群落和半流动沙漠的微生物群落代谢活性和功能多样性存在较为明显的差异。经过固沙的沙漠微生物对碳源的利用程度高；流动沙漠的微生物群落对碳源的利用相对较低，导致这种差异的主要因素可能包括：植物种类组成、植物残体、根系分泌物和土壤有机物等。说明经过固沙后沙漠表面有少量植被覆盖，使得沙漠表面光照适宜，外界干扰少，沙漠结构比较稳定，水分涵养好，为沙漠微生物栖息提供环境相对更为稳定的场所，因此更适合于微生物群落的发展，所以其微生物群落的活性相对较高，这与邵玉琴对结皮中微生物生物量和数量的研究相一致［1］。
本研究还表明，4种不同采样来源沙漠微生物群落的碳源利用类型出现不同，但是它们主要利用的碳源种类为羧酸类化合物、糖类和氨基酸类。利用ECO板上31种碳源作PCA主成分分析，第1主成分特征值的贡献率为70.16%，第2主成分特征值的贡献率为19.23%。由此说明影响沙漠微生物多样性的主要因素可能与碳源物质的来源，植物的根系分泌物等因素有密切关系。
有大量文献资料表明，在年降水量低于200mm的干旱沙漠地区，植物是不能顺利存活的，而沙坡头地区从1955～2009年平均降水量为188.2mm，因此通过植树造林等传统方式对该区域的沙漠进行治理是不可行的。除非配置引水灌溉系统，这对于水资源奇缺的干旱荒漠地区来说是不可能的，这样既违反了自然规律，增加了不必要的浪费，同时也难以达到治沙目的，因此，顺应自然规律，在干旱沙漠通过人工培养种植微生物结皮以治理沙漠是非常值得研究的重要课题。本实验的研究结果可以在今后人工培植微生物结皮时，根据不同环境需要，适当地优化和调整微生物群落所需要的碳源结构，用以诱导具有固沙功能的微生物繁殖并且加速沙漠微生物群落的演替速度，充分发挥微生物在沙漠化治理中的作用。
参考文献：
［1］赵吉，邵玉琴.草原沙地微生物结皮与固沙作用的研究［J］.农业环境科学学报，2004，23（1）：94-97.
