第13章 病原学、免疫学及生化检测 (6)
（3）实验室内部质量控制
①所检项目内控。菌落总数每批样品采用稀释液空白和培养基空白对照，总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希菌每批样品采用所需培养基做空白对照。
②环境内控。对净化室每天进行实时监测，每周进行1次空气消毒监测，每半年进行1次紫外灯效果监测，每年进行1次尘埃粒子监测。
三、化妆品的微生物检测
（一）基本理论
化妆品是一种清洁皮肤、滋润和保护皮肤，美化人民生活的用品，长期与人们的皮肤和黏膜接触。对化妆品的要求，必须保证安全、卫生和对人体无害。测定菌落总数可以用来判明化妆品被细菌污染的程度和生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程以及操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。粪大肠菌群来自温血动物和人的粪便，检出粪大肠菌群，表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌的危险。铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌分布广泛，能引起人体伤处化脓和局部化脓性病灶，严重可导致败血症，由于化妆品长期与人们的皮肤和黏膜接触，一旦人体皮肤有破损，化妆品中存在上述致病菌，则易引起人体破损处感染。因此，化妆品中检测铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌也是保证化妆品卫生质量的重要指标。此外，检测真菌和酵母菌可以反映化妆品被真菌和酵母菌污染的程度及其一般卫生状况。
（二）基本知识
1.化妆品的微生物指标 菌落总数、粪大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、真菌和酵母菌。
2.菌落总数
是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH、需氧性质等），1g（ml）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
3.粪大肠菌群
系一群需氧及兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌，在44.5℃±0.5℃培养24～48小时能发酵乳糖产酸、产气。
4.铜绿假单胞菌
属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长。
5.金黄色葡萄球菌
为革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。
6.真菌和酵母菌
是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g（ml）化妆品中所污染的活的真菌和酵母菌数量。
7.工作流程
接样→查看包装是否完整、采样数量是否符合要求→核对标签与送样单信息是否符合→样品放室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻→积极准备条件及时进行检验→规定的时间内出具结果→阴性样品及时处理，如检出粪大肠菌群或其他致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存1个月。
（三）基本技能
1.样品处理
（1）液体样品
①水溶性的液体样品。可量取10ml加到90ml灭菌生理盐水中，混匀后，制成1∶10检样。
②油性液体样品。取样品10ml，先加5ml灭菌液状石蜡混匀，再加10ml灭菌的吐温80，在40～44℃水浴中振荡混合10分钟，加入灭菌生理盐水75ml（在40～44℃水浴中预温），在40～44℃水浴中乳化，制成1∶10的悬液。
③膏、霜、乳剂半固体状样品。亲水性样品称取10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振摇混匀，静置后15分钟，用其上清液为1∶10检样。疏水性样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10ml灭菌液状石蜡，研磨成黏稠状，再加入10ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70ml灭菌生理盐水，在40～44℃水浴中充分混合，制成1∶10检样。
（2）固体样品：称取10g，加到90ml灭菌生理盐水中，充分振摇混匀，静置后，取上清液作为1∶10的检样。
2.操作步骤及结果报告
（1）菌落总数
①操作步骤。将上述制成的1∶10样液，用灭菌吸管吸取2ml分别注入2个灭菌平皿，每皿1ml，另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水管中，制成1∶100样液，吸取2ml分别注入两个灭菌平皿，每皿1ml，将融化并冷至45℃的卵磷脂吐温80营养琼脂倾入平皿，另取一个灭菌空平皿，倾入卵磷脂吐温80营养琼脂作为空白对照，凝固后翻转平皿置36℃±1℃培养48小时±2小时观察结果。
②结果报告。菌落总数报告参照本节第一部分食品菌落总数的报告方式，单位为cfu／ml（g）。
（2）粪大肠菌群
①操作步骤。取10ml1∶10样液，加到10ml双料乳糖胆盐发酵管，置44℃±0.5℃培养24～48小时，产酸、产气接种EMB，置36℃±1℃培养18～24小时，挑取可疑菌落镜检。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24小时±2小时，加入靛基质试剂约0.5ml做靛基质试验（阳性者液面呈玫瑰红色，阴性呈试剂本色）。
②结果报告。乳糖胆盐发酵管如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性，如产酸、产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
（3）铜绿假单胞菌
①操作步骤。增菌培养：取1∶10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置36℃±1℃培养18～24小时。分离培养：挑取培养物划线接种在十六烷三甲基溴化铵平板上，置36℃±1℃培养18～24小时。染色镜检；挑取可疑菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阴性者进行氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验、42℃生长试验。
②结果报告。经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
（4）金黄色葡萄球菌的操作步骤
①操作步骤。增菌培养：取1∶10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基，置36℃±1℃培养24小时±2小时。分离培养：挑取培养物划线接种在BairdParker平板或血琼脂平板上，置36℃±1℃培养24～48小时。染色镜检：挑取可疑菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阳性菌，排列成葡萄状，无芽孢，无荚膜进行甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验。血浆凝固酶试验：吸取1∶4新鲜血浆0.5ml，放入灭菌小试管中，加入待检菌24小时±2小时肉汤培养物0.5ml。混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察1次，6小时之内如果呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基0.5ml，分别加入灭菌1∶4血浆0.5ml，混匀，作为对照。
②结果报告。经证实为革兰阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品中检出金黄色葡萄球菌。
（5）真菌和酵母菌
①操作步骤。分别吸取1∶10、1∶100、1∶1000的检液2ml分别注入2个灭菌平皿，每皿1ml，将融化并冷至45℃±1℃的虎红琼脂倾入平皿，凝固后置28℃±1℃培养72小时±2小时观察结果。如蔓延生长，于48小时±2小时应及时取出平板计数。
②结果报告。应选菌落数在5～50个范围之内的平皿计数，参照本节第一部分食品菌落总数的报告方式，单位为cfu／ml（g）。
3.质量控制
（1）主要仪器
①恒温培养箱。每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
②高压灭菌器。记录好使用记录，每周1次灭菌效果监测，每年由计量部门检定1次。
③干热灭菌箱。记录好使用记录，每年由计量部门检定1次。
④恒温水浴锅。每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
（2）耗材
①主要耗材。卵磷脂吐温80-营养琼脂、乳糖胆盐培养液、伊红亚甲蓝琼脂、十六烷三甲基溴化铵培养基、SCDLP培养基、BairdParker培养基、虎红培养基。
②耗材质量控制。购进的每批培养基在使用前进行培养基质量鉴定，鉴定合格后使用，鉴定方法见第六部分培养基质量控制方法。
（3）实验室内部质量控制
①所检项目内控。菌落总数、真菌和酵母菌每批样品采用稀释液空白和培养基空白对照，粪大肠菌群每批样品采用所需培养基做空白对照。
②环境内控。对净化室每天进行实时监测，每周进行1次空气消毒监测，每半年进行1次紫外灯效果监测，每年进行1次尘埃粒子监测。
四、公共场所微生物检测
（一）基本理论
公共场所微生物检验包括公共场所空气检验、公共场所用品检验。主要检验项目有空气细菌总数测定。公共场所用品：茶具、毛巾、床上卧具、浴盆、脸（脚）盆细菌总数测定；茶具、毛巾、床上卧具、理发用具、浴盆、脸（脚）盆大肠菌群测定；理发用具金黄色葡萄球菌测定、拖鞋真菌和酵母菌测定。
（二）基本知识
1.公共场所空气微生物指标、细菌总数
（1）撞击法：采用撞击式空气微生物采样器采样，通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，从而使悬浮在空气中的带菌粒子撞击到营养琼脂平板上。
（2）自然沉降法：指直径9cm的营养琼脂平板在采样点暴露5分钟，经36℃±1℃恒温箱中、培养48小时后，计数生长的细菌菌落数的采样测定方法。
（3）采样方法：撞击法、自然沉降法2种。常规采用自然沉降法，此法优点是简单方便，缺点是对小粒子捕获率低。撞击法对空气中的带菌粒子捕获率高，但操作较复杂，需仪器设备。
2.公共场所用品微生物指标 细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、真菌和酵母菌
3.工作流程 接样→查看样品是否有破损→核对样品编号与送样单编号是否符合→核对无误后空气样品按标准要求置温箱中培养，公共场所样品按标准及时检验→规定时间内出具结果。
（三）基本技能
1.操作步骤及结果报告
（1）公共场所空气细菌总数的操作步骤及结果报告
①撞击法。将采样后的营养琼脂平板
置36℃±1℃恒温箱中、培养48小时后观察结果。根据仪器说明书计算，计算每立方米空气中所含的细菌菌落数。以每立方米菌落数（cfu／m3）报告结果。
②自然沉降法。将采样后的营养琼脂平板置36℃±1℃恒温箱中、培养48小时后观察结果。计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数。以每平皿菌落数（cfu／皿）报告结果。
（2）公共场所用品细菌总数（涂抹法）
①公共场所用品的采样方法。茶具：用浸有灭菌生理盐水的棉拭子在口唇接触处茶具内外缘涂抹50cm2，采完后放入装有10ml灭菌生理盐水的试管中；毛巾、床上卧具：用浸有灭菌生理盐水的棉拭子在样品对折后两面的中央各25cm2内涂抹，采完后放入装有10ml灭菌生理盐水的试管中；浴盆：用一浸有灭菌生理盐水的棉拭子在样品25cm2内涂抹，共采5个棉拭子放入装有125ml灭菌生理盐水的烧瓶中，每ml的菌浓度相当于1cm2的菌量；脸（脚）盆：用一浸有灭菌生理盐水的棉拭子在样品25cm2内涂抹，共采2个棉拭子放入装有50ml灭菌生理盐水的烧瓶中，每ml的菌浓度相当于1cm2的菌量。
②操作步骤，将采样后的试管或烧瓶充分振摇，吸2ml分别注入2块灭菌平皿内，每皿1ml，如污染严重，可10倍递增稀释，倾入融化并冷至45℃营养琼脂后，置36℃±1℃培养48小时。
③结果报告。茶具细菌总数计算公式：细菌总数cfu／cm2=（平均菌落数×稀释倍数）／采样面积；毛巾、床上卧具细菌总数计算公式：细菌总数，cfu／25cm2=（平均菌落数×稀释倍数）／2；浴盆、脸（脚）盆细菌总数计算公式：细菌总数，cfu／25cm2=25×稀释倍数×平均菌落数
（3）公共场所用品大肠菌群操作步骤及结果报告
①发酵法。用测定细菌总数剩余的检样，倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中。理发刀具吸取5ml检样倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中。置36℃±1℃恒温箱中、培养24小时后观察结果。若产酸、产气，则转种EMB平板上，置36℃±1℃恒温箱中培养18～24小时后，观察菌落形态，并做革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管置36℃±1℃培养24小时做证实试验。如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性，凡证实试验产酸、产气，革兰阴性无芽孢杆菌，即可报告检出大肠菌群。
②纸片法。将已采样的纸片置36℃±1℃恒温箱中培养16～18小时，观察结果。按照纸片说明书报告结果。
（4）公共场所理发刀具金黄色葡萄球菌
