第13章 病原学、免疫学及生化检测 (7)
①操作步骤。将大肠菌群检测后剩余的5ml检样，放入45ml7.5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基中，置36℃培养24小时，接种BairdPairker培养基或血平板，置36±1℃培养24小时，挑取可疑菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阳性菌，排列成葡萄状，进行甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验试管法：吸取1∶4新鲜血浆0.5ml，放入灭菌小试管中，加入待检菌24小时±2小时肉汤培养物0.5ml。混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察1次，24小时之内如果呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基0.5ml，分别加入灭菌1∶4血浆0.5ml，混匀，作为对照。
②结果报告。参照本节第三部分化妆品金黄色葡萄球菌的报告方式。
（5）公共场所拖鞋真菌和酵母菌的测定
①操作步骤。1∶10检样充分振摇后，吸2ml分别注入2块灭菌平皿内，每皿1ml，选择3个适宜稀释度，倾入虎红琼脂后，置25～28℃培养，3天后开始观察，共培养观察7天。
②结果报告。通常选择菌落数在30～100之内的平皿计数，参照本节第一部分食品菌落总数的报告方式，计算公式：真菌菌落数，cfu／50cm2=每皿的平均真菌菌落数×稀释倍数（注：采样面积为50cm2）。
2.质量控制
（1）主要仪器
①恒温培养箱，每天观察记录温度情况，每年由计量部门检定1次。
②高压灭菌器，记录好使用记录，每周1次灭菌效果监测，每年由计量部门检定1次。
③干热灭菌箱，记录好使用记录，每年由计量部门检定1次。
（2）耗材
①主要耗材。营养琼脂、乳糖胆盐培养液、伊红亚甲蓝琼脂、7.5％氯化钠肉汤、BairdPairker培养基、血琼脂、虎红培养基。
②耗材质量控制。购进的每批培养基在使用前进行培养基质量鉴定，鉴定合格后使用，鉴定方法见第六部分培养基质量控制方法。
（3）实验室内部质量控制
①所检项目内控。细菌总数、真菌和酵母菌每批样品采用稀释液空白对照和培养基空白对照；大肠菌群每批样品采用所需培养基做空白对照。
②环境内控。对净化室每天进行实时监测，每周进行1次空气消毒监测，每半年进行1次紫外灯效果监测，每年进行1次尘埃粒子监测。
五、消杀样品微生物检测
（一）基本理论
消杀样品种类繁多，目前我们所检验的包括医院消毒监测样品、托幼机构消毒监测样品、一次性使用卫生用品产品类样品、一次性使用卫生用品生产场所类样品、一次性使用医疗用品灭菌类样品。根据样品的类别和标准的要求，所检的项目不同。本节只介绍医院消毒监测样品、一次性使用卫生用品产品类样品、一次性使用卫生用品生产场所类样品。
（二）基本知识
1.医院消毒监测微生物学指标
（1）细菌菌落总数：样品为各类从事医疗活动的环境空气、物体表面、医护人员手表面、使用中消毒剂与无菌器械保存液。
（2）无菌检查：样品为进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤和黏膜的医疗用品。
（3）粪大肠菌群：样品为医疗机构污水。
（4）压力蒸汽灭菌设备灭菌效果：指示菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢（ATCC7953或SSIK31株）。
（5）沉降菌浓度：样品为各类从事医疗活动的洁净手术室空气。
2.一次性使用卫生用品产品类样品微生物学指标
细菌菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌、真菌菌落总数。
3.一次性使用卫生用品生产场所类样品微生物学指标
（1）细菌菌落总数：样品为生产场所环境空气、工作台表面、工人手表面。
（2）致病菌（金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌）：样品为生产场所工作台表面、工人手表面。
（3）工作流程：接样→查看样品是否有破损以及包装情况→核对样品编号与送样单编号是否符合以及信息是否符合→核对无误后积极准备条件及时进行检验→规定的时间内出具结果。
（三）基本技能
1.医院消毒监测项目的操作步骤及结果报告
（1）各类从事医疗活动的环境空气细菌菌落总数
①操作步骤。用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5分钟后送检培养。置37℃培养48小时后观察结果。
②结果报告。空气细菌菌落总数（cfu／m3）=［50000×平均菌落数（cfu／Ⅲ）］／［平板面积（cm2）×平板暴露时间（分钟）］
（2）物体表面细菌菌落总数
①操作步骤。被采表面<100cm2，取全部表面；被采表面>100cm2，取100cm2。用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子采样，采完后放入装有10ml采样液的试管中，充分混匀后，参照本节第三部分化妆品菌落总数操作步骤操作。
②结果报告。物体表面细菌菌落总数（cfu／cm2）=（平皿上菌落的平均数×采样液稀释倍数）／采样面积（cm2）
（3）医护人员手表面细菌菌落总数
①操作步骤。参照上述物体表面的方法，采样面积为双手（一只手涂擦面积约30cm2）。
②结果报告。参照上述物体表面的计算公式报告
（4）使用中消毒剂与无菌器械保存液细菌菌落总数
①操作步骤。在无菌条件下，用灭菌吸管吸取1ml被检样液，加入9ml稀释液中混匀，对于醇类与酚类消毒剂，稀释液用普通营养肉汤即可；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在肉汤中加入0.1％硫代硫酸钠，对于氯己定、季铵盐类消毒剂，需在肉汤中加入3％吐温80和0.3％卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在肉汤中加入0.3％甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种复方消毒剂，需在肉汤中加入3％吐温80，以中和被检样液的残效作用。检测细菌菌落总数的操作步骤参照上述物体表面的方法。
②结果报告。细菌菌落总数，（个／ml）=平皿上菌落的平均数×采样液稀释倍数。
（5）医疗用品无菌检查
①操作步骤
a.培养基质量检查：需氧菌、厌氧菌培养基经接种每1ml含100个以下的藤黄八叠球菌（28001）菌液1ml，置30～35℃培养24小时，生长良好。需氧菌、厌氧菌培养基经接种每1ml含50个以下的生孢梭菌（64941）菌液1ml，置30～35℃培养24小时，生长良好。真菌培养基经接种每1ml含50个以下的白色念珠菌菌液1ml，置20～25℃培养24小时，生长良好。
b.制备供试液：输液（血）器、注射器制备供试液，供试液应在制备后2小时内使用。对不能用破坏性方法取样的医疗用品，可按物体表面细菌菌落总数采样方法制备供试液。
c.试验方法：将供试液分别接种于需氧菌、厌氧菌培养基5管，其中1管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml（培养后稀释成1∶106），供作阳性对照。另接种于霉菌培养基2管。供试液在2～20ml，每管接种1～15ml培养基中，供试液在20ml以上，每管接种5～40ml培养基中。实体类（如棉签等）直接投入培养基，敷料、手术衣等样品于不同部位取样。接种后，需氧菌、厌氧菌培养基在30～35℃培养培养5天，阳性对照管应在接种后24小时有菌生长，真菌培养基在20～25℃培养7天。
②结果报告。培养期间逐日检查，如阳性对照管混浊，其他各管均不混浊，则可判断供试品合格，如阳性对照管混浊，需氧菌、厌氧菌、真菌培养基各管中任何一管混浊，需证明有无菌生长，如无菌生长，则可判断供试品合格，如有菌生长，则应重新取样，分别依法复测2次，除阳性对照管混浊，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。
（6）医疗机构污水粪大肠菌群
①操作步骤。污水样品应至少取200ml，使用前应充分混匀。若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5％硫代硫酸钠充分中和余氯。根据污染程度，选择3个适宜稀释度，每个稀释度接种5管。若接种量为10ml，则取10ml污水接种到装有5ml三倍浓缩的乳糖胆盐发酵管内，若接种量为1ml，则取1ml污水接种到装有10ml单料乳糖胆盐发酵管内，若接种量＜1ml，则取1ml样品稀释液接种到10ml单料乳糖胆盐发酵管内，接种完后置44.0℃培养24小时观察结果。如有产酸、产气管，则转种EMB平板，置37℃培养18～24小时观察结果。挑取可疑菌落进行革兰染色镜检，同时接种于盛有5ml乳糖蛋白胨培养液中，置44℃培养24小时做证实试验。
②结果报告。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为粪大肠菌群阴性，如有产酸、产气管，根据证实为粪大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每升污水中粪大肠菌群的MPN值。
（7）压力蒸汽灭菌效果生物检测法
①操作步骤。经过一个灭菌周期，在无菌条件下，取出指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56℃±1℃培养7天（自含式生物指示物按说明书执行），观察培养基颜色变化。检测时设阴性、阳性对照。
②结果报告。培养基紫色为阴性，判定为灭菌合格；培养基变成黄色为阳性，则灭菌过程不合格。
（8）各类从事医疗活动的洁净手术室空气沉降菌浓度
①操作步骤。将已采集的培养基，于37℃培养24小时观察结果，每次检测必须有2次空白对照，对照1为每批培养基空白对照，对照2为每室或每区操作过程对照皿。
②结果报告。取平均值四舍五入保留小数点后一位，代表空气中可以沉降下来的细菌数，个／皿。
2.一次性使用卫生用品产品类样品
（1）样品处理：在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品，剪碎后加入到200ml灭菌生理盐水中，充分混匀。液体产品用原液直接做样液。如被检样品大量吸水不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50ml递增，直至能吸出足够样液时。在计算细菌菌落总数、真菌菌落总数时相应调整稀释度。
（2）操作步骤及结果报告
①细菌菌落总数。操作步骤：待上述生理盐水自然沉降后取上清液做菌落计数。接种5个平皿，每个平皿中加入1ml上清液，倾入冷却至45℃的营养琼脂15ml混匀，凝固后置35℃±2℃培养48小时观察结果。结果报告：菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按公式计算：细菌菌落总数，cfu／g（ml）=（5块营养琼脂平板上的细菌菌落总数×稀释度）／5。当菌落数在100以内，按实有数报告，＞100时采用两位有效数字。
②大肠菌群。操作步骤：取样液5ml接种50ml乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃培养24小时，产酸、产气管接种EMB，置35℃±2℃培养18～24小时，挑取可疑菌落进行革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置35℃±2℃培养24小时，观察产气情况。结果报告：如乳糖胆盐发酵管不产酸产气管，则报告大肠菌群阴性，如乳糖胆盐发酵管产酸、产气，在EMB平板上有典型菌落，革兰染色为阴性无芽孢杆菌，则可报告被检样品检出大肠菌群。
③绿脓杆菌。操作步骤：取样液5ml加到50mlSCDLP液体培养基，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24小时后，挑取培养物划线接种在十六烷三甲基溴化铵平板上，置35℃±2℃培养18～24小时。挑取可疑菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阴性者进行氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验、42℃生长试验。结果报告：经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
④金黄色葡萄球菌。操作步骤：取样液5ml加到50mlSCDLP液体培养基，充分混匀，置35℃±2℃培养24小时后，接种血平板，置35℃±2℃培养24～48小时，挑取可疑菌落，涂片，革兰染色镜检。镜检为革兰阳性菌，排列成葡萄状，无芽孢与荚膜，进行甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验（本试验在本节第四部分公共场所理发用具金黄色葡萄球菌检测中介绍过）。结果报告：凡在琼脂平板上有可疑菌落，经证实为革兰阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品中检出金黄色葡萄球菌。
