2.非构建文库所使用的细胞核DNA的抽提
常采用CTAB法和SDS 法来抽提植物基因物总DNA，抽提出来的DNA基本上是细胞核DNA。CTAB 法提出的DNA纯度较高，且能除去多糖类物质，但如果所需要的DNA量不多，要求也不高，可使用SDS 法微量抽提。SDS 法提取DNA时，只需要取新鲜叶片1g 左右，用液氮研磨成粉末，倒入2mL的离心管，加入800μL1.5%SDS微量抽提液，65℃水浴30min，加入等体积的氯仿/异戊醇/乙醇（76：4：20），混匀后，12000r/min离心8min，上清液转移到1.5mL离心管，加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇沉淀，12000r/min离心3min，弃上清，用0.5mL70%的乙醇漂洗，风干，溶于50～100μL TE备用。
对于植物细胞核DNA的抽提，应根据实验目的选用不同的抽提方法。另外，不同的植物材料，抽提的方法也略有不同，如果是植物材料本身含糖量比较高，通常采用以下方法处理：
①在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100mmol/L Tris·HCl（pH＝8.0）、5mmol/L EDTA 和0.35mol/LSorbitol 洗几次。②使DNA提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。③沉淀DNA时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5mol/L NaCl，或加NH4Ac，使终浓度为10mmol/L ；或0.5mL DNA液中加0.125mL 4mol/L NaCl和0.625mL 13%PEG8000（冰浴1h）。④多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。如用TE 缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用乙醇沉淀DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下DNA部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还有在提取缓冲液中加一定量的氯苯（1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。
上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上降低DNA的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对DNA具有特异性吸附的树脂来纯化DNA。
4.1.3核外DNA的提取
作为遗传物质的DNA，除细胞核DNA外，在植物中还有线粒体DNA和叶绿体DNA，在动物中有线粒体DNA，细菌中有质粒DNA。其中质粒DNA的应用最为广泛，基因的克隆与鉴定、载体骨架的构建等都离不开质粒DNA。因此，我们首先介绍质粒DNA的抽提。
以大肠杆菌为例，在大肠杆菌中的质粒有大有小，拷贝数有高有低，因此分离的方法也多种多样。在实践中最常见的操作是通过碱裂解法提取高拷贝的小质粒。
一般从对数生长期的大肠杆菌细胞中提取质粒。由于绝大多数基因操作的质粒载体都带有抗生素抗性基因，为了保证在生长过程中质粒不会丢失，所以在生长培养基中要加入适量的抗生素。最常见的抗生素是氨苄青霉素，其次是四环素、氯霉素和卡那霉素。
1.碱裂解法提取E.coli 质粒DNA的原理
碱裂解法提取质粒DNA是经典的方法，由Birnboim 和Doly 设计并于1979年发表。该方法不仅用于大肠杆菌质粒DNA的提取，其工作原理也广泛应用于其他微生物质粒的提取。
裂解法提取质粒的整个过程主要用到3种溶液，即溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。其核心原理是，在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。对于高拷贝的质粒，如pUC 和pGEM 系列质粒，一般每毫升培养液可得到3～5μg DNA，可以满足大多数常规DNA的操作。
在微量抽提过程中，一般取1～2mL 菌体培养物，用缓冲液洗去残液和菌体碎片或分泌物。要提取质粒必须首先破碎细胞让质粒从细胞中游离出来。为此，第一步先用溶液Ⅰ将细胞悬浮起来。该溶液含有50mmol/L 葡萄糖和10mmol/L EDTA，其中葡萄糖用于在溶菌酶作用时维持渗透压；而EDTA是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，用于抑制DNase的活性和抑制微生物的生长。由于E.coli容易破裂，现在不再加溶菌酶了。但尽管如此，人们仍然习惯使用溶液Ⅰ的初始配方。第二步加入2倍于溶液Ⅰ体积的溶液Ⅱ，该溶液含有0.2mol/L NaOH和1%SDS。在这种情况下，细胞会很快破裂，使混浊的细胞悬浮液变成完全澄清的黏稠液体，此时，在pH12.0～12.5这样狭小的范围内染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA释放到上清中。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕形成大型复合物，后者被SDS 包被。虽然碱性溶剂使碱基配对完全破坏，但闭环的质粒DNA双链不会彼此分离，因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。最后，加入1.5倍于溶液Ⅰ体积的溶液Ⅲ，该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液（3mol/L，pH4.6）。在中和过程中，钾离子取代SDS 中的钠离子，复合物从溶液中沉淀下来。质粒DNA在变性之后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高速离心，上清液即为质粒DNA粗制品。在该粗制品中含有大量的盐，以及小分子RNA和部分蛋白质，一般不能直接使用。用两倍体积的乙醇进行DNA沉淀，便可获得质粒DNA样品。此时，该样品可满足一般的操作要求，如酶切等。在乙醇沉淀之前，可用RNaseA 去除RNA，用苯酚/氯仿抽提去除蛋白。如果要得到更高纯度的样品，可做进一步纯化处理，如密度梯度离心等。
2.碱裂解抽提质粒DNA过程中应注意的问题
（1）碱抽提法成功的标志是把染色体DNA、蛋白质和RNA去除干净，获得一定质量的质粒DNA。去掉染色体最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入NaOH‐SDS溶液与3mol/L aAc（pH4.8）溶液，控制好变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂成小片断，且能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶菌液加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，但当加入SDS以后，则要注意不能过分振荡，但又必须让它反应充分，这是一对矛盾，要处理适当。
（2）当加入NaOH‐SDS溶液5min后，没有看到溶液变黏稠时，不能进行下一步实验。要检查所用的试剂是否正确，质量是否符合实验要求（对SDS的质量要求较高，有报道曾用未经重结晶的分析纯的SDS，实验没有成功，后来改用进口的Sigma产品，质粒DNA的收得率很高），待找到原因补救后才可继续做下去，不然，提取到最后，将提不到质粒DNA或收得率极低。
（3）在提取时使用的试剂，除了要用重蒸水配外，所用器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要进行高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酚对DNA的降解。对Eppendorf 管子、Tip 或非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃高温干燥箱中烘干使用。
（4）加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖颠倒摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放入冰箱中去沉淀DNA。
（5）乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管内壁的上清液抽干或自然挥发，不然，用TE 缓冲液溶解DNA时，既困难又不安全。在用真空泵抽真空时，气流太强易使DNA飞溅而损失，所以在装有DNA的管口常用Parafilm 包装于管口或覆盖一层薄纸，在纸上打若干个小洞。另外，抽真空时间也不要太长，防止DNA成粉末状而遭损失。
（6）最后一次沉淀DNA用的离心管应是干净、灭过菌、最好是经过硅化的管子（极少量的TE 缓冲液不会因吸附在壁上不能完全收集而损失质粒DNA）。
碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。该方法操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于相对分子质量较大、拷贝数较少的质粒DNA，由于DNA片段大易于损伤断裂，因此可选用氯化铯密度梯度离心法抽提DNA。该方法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。
3.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA
现在有些公司开发出了纯化质粒DNA的试剂盒，着名的有Qiagen 公司的产品，如QIAprep Spin Miniprep Kit。其核心技术是使用一种特制的微型离心纯化柱（QIAprep spincolumn），在柱中有一种特殊的硅胶膜（silica membrane）。在高浓度盐条件下该膜可以结合多至20μg 的DNA，最后用小体积的水或低离子强度的缓冲液可将DNA洗脱出来。
分离纯化过程是通过一个简单的结合-洗涤-洗脱程序来完成的。首先用碱裂解法获得质粒DNA粗制品，之后将样品通过纯化柱的硅胶膜，使之吸附质粒DNA。然后用50%乙醇洗涤滤膜，洗去杂质，最后用少量洗脱缓冲液或水洗脱出纯DNA。纯化的质粒DNA适合大多数酶学反应，包括限制性酶切和DNA测序等。除了从大肠杆菌纯化质粒外，从酿酒酵母、枯草牙胞杆菌和根瘤农杆菌中纯化质粒DNA亦可用试剂盒。
这种方法操作简便、回收率高，洗脱出来的DNA可立即使用，无需沉淀、浓缩或脱盐。因此该产品越来越受到研究工作者的青睐，但同时也有忘却质粒DNA分离纯化原理的倾向。
除了上述方法外，还有其他方法用于大肠杆菌质粒的提取，对相对分子质量大且拷贝数很低的质粒有专门的分离方法。
除质粒DNA，核外DNA在植物中还有线粒体DNA和叶绿体DNA，动物中也有线粒体DNA。植物线粒体DNA与核DNA相比，在细胞内含量甚微，提取过程中极易被细胞核及叶绿体DNA污染，因此有一些特殊的抽提方法；同样，叶绿体DNA以及动物线粒体DNA也有各自特殊的抽提方法。
国外提取纯化水稻线粒体DNA的方法有：Douce 方法、Pring 方法和Levings 方法，国内有蔗糖不连续梯度方法等。国外提取线粒体的方法需要的试剂价格昂贵、购买困难等，而国内所用的蔗糖不连续梯度方法步骤繁琐，特别在吸取中间层黄色液时比较困难，费时又耗材。
高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNase Ⅰ法、蔗糖密度梯度离心法、Percoll 梯度法、无水法和高盐低pH法等。
动物线粒体DNA的提取方法，主要有：①氯化铯密度梯度离心法，此法不但设备昂贵，而且实验时间较长，目前已经很少使用；②柱层析法，此法所需设备也较昂贵，而且实验时间也较长；③DNase 法，此法在差速离心获得线粒体后，通过DNase 消化，有效地去除线粒体表面附着的核DNA，是目前常用的方法；④碱裂解法，此法是借鉴质粒快速提取法而建立的，在差速离心获得线粒体后，通过碱裂解变性，高盐溶液复性，分离环状的线粒体DNA和线性的核DNA，从而获得线粒体DNA，此法也是目前常用的方法；⑤改进高盐沉淀法，利用SDS（十二烷基磺酸钠）破坏细胞膜、核膜，使蛋白质变性，从而游离出核酸。EDTA 能抑制细胞中DNA酶的活性。蛋白酶K 进一步将蛋白质降解成小肽。加入饱和乙酸钠后，绝大部分线性大相对分子质量DNA和蛋白质在SDS 作用下变性形成沉淀，而环状线粒体DNA仍为自然状态，通过高速离心，除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质，线粒体DNA仍留在上清中，此法在碱裂解法的基础上做了一些改进，它们的原理是一样的，都是效仿质粒的提取方法。
4.1.4RNA的提取
cDNA文库的构建、蛋白质体外翻译、Northern 斑点分析等需要一定纯度和一定完整性的RNA。能否获得完整的RNA，取决于能否最低限度地避免提取和纯化过程中内源及外源RNase 对RNA的降解。由于mRNA分子结构的特点，容易受RNase 的攻击而降解，加上RNase 极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNase 的污染，并设法抑制其活性。所有的组织中均存在RNase，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部操作过程均需戴手套并经常更换。
