RNA酶抑制剂主要有：①RNA酶的蛋白质抑制剂。目前从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，可使RNA酶失活。此蛋白质在体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子。由于酚抽提可以去除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。②氧钒核糖核苷复合物。这种由氧钒（ Ⅳ)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是一种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在蛙卵母细胞中进行翻译，并能作为某些体外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1%羟基喹啉的苯酚多次抽提以去除之。
细胞内总RNA的抽提方法很多，在实难室中常采用的方法有两种，一种是酚异硫氰酸胍抽提法和硅胶膜纯化法。
1.酚异硫氰酸胍抽提法
TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，由Gibco 公司根据酚异硫氰酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，适用于绝大多数生物材料。对任何生物材料的RNA的提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入TRIZOL 试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分，还可保持RNA的完整；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。该RNA样品几乎不含蛋白质和DNA，可直接用于Northern 杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNase 保护分析（RNase protection assay）和分子克隆。
2.硅胶膜纯化法
RNeasy 试剂盒由Qiagen 公司设计，其设计思路与DNA的分离纯化思路相似，也就是含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA吸附在硅胶膜上，从而与其他细胞成分分开，然后在低盐浓度下RNA可从硅胶膜上洗脱出来。其技术将异硫氰酸胍裂解的严格性和硅胶膜纯化的速度和纯度相结合，简化了总RNA的分离程序。相当于将异硫氰酸胍裂解法制备的RNA的水相，通过硅胶膜来纯化。用该试剂盒分离纯化的RNA纯度高，含有极少量的共纯化DNA。
上述两种方法纯化的RNA如果要用于对少量DNA也敏感的某些操作，如PCR操作，可使用无RNA酶的DNase Ⅰ（RNase Free DNase Ⅰ）处理去除痕量的DNA。如果需要特别纯净的样品，可以通过CsCl 密度梯度离心来纯化。
分离的总RNA可利用mRNA3′末端含有poly（A）＋的特点，当总RNA流经oligo（dT）纤维柱时，在高浓度盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo（dT）纤维素柱上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
核酸提取注意事项如下：
（1）在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
（2）有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度为5mmol/L 的EDTA 代替NaCl，并且可将反应温度提高到50～60℃，并将反应时间缩短到15～25min，但酶用量必须提高10～20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。
（3）许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的醌类物质，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP 和巯基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离，且PVP 与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
（4）许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法：CTAB 多次抽提；在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀；在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5mol/L NaCl 作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5～1/2的体积，异丙醇可用到0.6～1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐的存在将使大量多糖存在溶液中，从而达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
（5）在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此用酚抽提后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中既可单用氯仿作变性剂，也可用酚/氯仿混合液作变性剂，也可单用酚作变性剂，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿抽提。
（6）在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积的乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。在提取核酸时如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下大于30min ；－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
（7）在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水，因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外，核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。
核酸提取后可通过PCR、RT PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库，然后由RACE、DD PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。
4.1.5核酸的纯化
1.超离心
许多细胞器和生物大分子在普通离心力场中不易沉淀，必须在高速或超速（一般以每分钟2万转以上为超速）离心力场中才会沉降。超离心按原理可分为两类：沉降速度超离心和沉降平衡超离心。这两种超离心可用于分析实验，测定核酸的相对分子质量、沉降系数（S）或浮密度（ρ），也可用于制备实验以纯化核酸制品。
（1）沉降速度超离心 根据被分离物质在强大的离心力场中沉降速度的不同进行分离。
核酸的沉降速度与核酸的相对分子质量、形状、离心力场的强度及介质的黏度有关。离心力场强度越大、介质黏度越小，则沉降速度越快；核酸相对分子质量越小、形状越伸展，则沉降速度越慢，沉降系数相应也越小。
沉降速度法中常用5%～20%（W/V）蔗糖，用梯度仪或手工预先在离心管中铺设好连续梯度或阶段梯度，再将核酸样品铺于梯度之上，离心后分部收集，用电泳法或紫外吸收法检测各分部，即可知核酸所在部分。
（2）沉降平衡超离心 根据被分离物质浮密度ρ（溶剂化密度）的不同进行分离。核酸的浮密度与核酸的碱基组成、高级结构及溶液介质有关。含GC 越多、结构越紧密的DNA浮密度越高，不同介质与核酸结合情况不同，会使其浮密度发现变化。
2.凝胶电泳
凝胶电泳是目前应用很普遍的分离纯化核酸的方法，操作简便，设备易置，而且快速灵敏，在琼脂糖凝胶电泳时，荧光染料EB（溴乙啶）能插入DNA或RNA的碱基对平面之间而形成荧光络合物，在紫外光的激发下产生橘黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB 的量与DNA分子长度和数量成正比，所以荧光强度可以表示DNA量的多少。用荧光染料溴乙啶（EB）染色，可检测到少至1ng 的DNA。如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5～10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1mg的DNA。
除了分离纯化核酸外，胶电泳还常用于鉴定核酸制品的纯度和测定核酸的含量及相对分子质量。胶电泳的材料一般有两种凝胶，一种是聚丙烯酰胺（polyacrylamide gel，PAG），孔径小，适合分离1000个核苷酸以下的核酸分子。另一种是琼脂糖凝胶（agarose），孔径大，适合分离较大的核酸分子。
3.柱层析
与其他纯化方法相比，柱层析的优点是容量大，分离量可达毫克级甚至克级水平。柱层析按原理分有如下几种：凝胶层析、离子交换层析、亲和层析，此外还有体外重组DNA法、R‐loop法和免疫法等。
4.2核酸的检测与保存
4.2.1核酸的检测
由于所用材料的不同，得到的核酸产量及质量均不同。分离纯化的DNA是否真的存在、是否有降解现象以及DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何等在基因操作中所面临的问题，均需检测所获得核酸的产量和质量。
目前采用的方法很多，如直接用紫外光谱分析法、EB 荧光分析法和琼脂糖电泳检测。其中最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖电泳检测。
1.紫外光谱分析法
由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在紫外260nm 波长处有最大吸收峰，这个性质可用于核酸的定性和定量测定，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。这要与蛋白质在280mm 波长处有最大的吸收峰相区别，又因为分子生物学实验核酸提取过程中，蛋白质是最常见的杂质，故常用OD260/OD280来检测提取的核酸纯度如何。
核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30%～40%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的。
天然双链DNA在260nm 处的吸收值与在280nm 处的吸收值的比值（A260/A280）为1.8左右。RNA在260nm 和280nm 处的吸收值之比约为2.0。根据核酸溶液在260nm 波长处的紫外吸收值，可按下式大致估算核酸的浓度：1A260＝ 50μg/mL（双链DNA），1A260＝ 40μg/mL（单链DNA、RNA），1A260＝ 20μg/mL（寡核苷酸）。
衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值。当OD260/OD280值＞ 1.8时，说明含RNA等杂质；当OD260/OD280值＜ 1.8时，说明含蛋白质和苯酚等。当OD260/OD280＜ 0.9时，该样品可适当稀释，用TE 饱和的酚、氯仿异戊醇各抽提一次，再用无水乙醇沉淀、抽干，TE悬浮，再用紫外分光光度计测定。由于测定OD260时，难以排除RNA、染色体DNA以及DNA解链的增色效应的影响，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。用紫外分光光度法可以通过OD260和OD280测出DNA的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能区分染色体DNA。
2.琼脂糖电泳检测
琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，在高温水溶液下会溶解，在常温下凝固并形成一定大小孔径的惰性介质。在电场的作用下，DNA可在孔洞中迁移，迁移的速率与DNA的物理尺寸有关，从而可用来分离不同相对分子质量大小的DNA分子。
电泳过程中，先将DNA样品与上样缓冲液混合在一起。上样缓冲液含有40%的蔗糖，用于将DNA样品沉积在点样孔内，使样品不易扩散；还含有溴酚蓝等指示剂，用于观察电泳的进程。在大多数情况下，DNA样品都是在大约pH8.0的条件下进行保存或分析的，在这一pH条件下，DNA最稳定，带负电荷，因此，DNA的泳动方向是从负极到正极。一般使用的电压为5V/cm 左右。在电泳进程中，常用一个已知含量和相对分子质量的DNA样品做对照，用来比对待测样品的相对分子质量和含量。DNA样品在电泳时泳动的速率与相对分子质量的大小成反比，另外DNA的结构也会影响其泳动速率。对相对分子质量相同的DNA分子，其物理构象越接近球状，泳动时遇到的阻力就越小，泳动就越快。质粒DNA有3种构象，即共价闭合环状超螺旋型DNA、线状DNA和缺口环状DNA，它们的泳动速率依次递减。
