4.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）早在1959年由Raymond和Weintraub 建立，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的界面电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N′四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，聚合形成长链——聚丙烯酰胺链，在交联剂（N，N′亚甲双丙烯酰胺）的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉连接而成的三维网状结构。
这种三维网状空间结构属不带电荷的非离子型多聚物，在电场中的电渗和吸附作用小。
在实际应用中，根据被分离物质相对分子质量的大小而选择适宜孔径的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的浓度来控制。丙烯酰胺的浓度可以在3%～30%（体积分数）之间变化，丙烯酰胺浓度低的凝胶具有较大的孔径，如3%的凝胶孔径大，对蛋白质分子具有分子筛作用，可用于根据蛋白质相对分子质量进行分离的电泳中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别分离物质。这种介质既具有分子筛效应，又具备静电效应，所以分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，它适用于低相对分子质量蛋白质（低于100）、寡聚核苷酸的分离和DNA的序列分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳具备分离只相差1个核苷酸的不同DNA片段的特性，是DNA序列分析因素中的关键技术之一。
目前应用比较广泛的是垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳，将聚丙烯酰胺凝胶灌于两块封闭的平板之间，然后进行垂直电泳。其原理主要是氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，在封闭的双层玻璃平板的夹层中灌胶后，仅有顶层的部分凝胶与空气中的氧气接触，从而大大降低了氧对聚合的抑制作用。
聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳常采用银染法来观察核酸条带。因为银染色液中的银离子（Ag＋）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag＋还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低相对分子质量蛋白质、小于1kb 的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差1bp的核苷酸分子也能分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳EB染色只能检出＞10ng以上的DNA条带；要求更高的灵敏度，可用银染。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的。
虽然聚丙烯酰胺凝胶的灌制比琼脂糖凝胶繁杂，但有以下几个优点是琼脂糖凝胶所不具备的：①分辨率极高：即使最大的片段比最小的片段长500倍（如1bp 与500bp）也能分离；②比琼脂糖凝胶的上样量大：在10mm×1mm 胶孔中上10μg DNA样品，分辨率无明显下降；③回收的DNA样品纯度高；④聚丙烯酰胺凝胶无色透明，紫外吸收低，抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好。
在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时有几点须注意：①操作时应持玻璃板边缘，避免手上的油脂印在玻璃板的工作面上，以免灌胶时产生气泡。②注意避免梳齿下带进气泡，检查是否有丙烯酰胺液泄漏。③凝胶和电泳储液槽中使用的TBE 要同期配制，否则影响电泳效果。
④电压不宜过高，电压过高将引起升温，导致DNA带形弯曲，甚至使小的DNA片段解链。
⑤丙烯酰胺与亚甲双丙烯酰胺在储存过程中，因光或碱的催化，会慢慢转变成丙烯或双丙烯酸。为此，应将它装入棕色瓶中4℃保存。⑥凝胶一般厚0.5～2mm，过厚的凝胶会因产热而影响电泳结果。⑦ 丙烯酰胺是一种神经毒素，可经皮肤吸收，应小心操作，操作时需戴手套和面罩。
4.4分子杂交技术
分子杂交是分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子。
杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。
若杂交的目的是识别靶DNA中的特异核苷酸序列，这需要牵涉到另一项核酸操作的基本技术——探针（probe）的制备。探针是指带有某些标记物（如放射性同位素32P，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸序列片段。若我们设法使一个核酸序列带上32P，那么它与靶序列互补形成的杂交双链，就会带有放射性。以适当方法接受来自杂交链的放射信号，即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。
根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern 杂交和Western 杂交以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。在主要的分子杂交过程中，都采用了印迹转移这一核心技术，都是先将DNA或RNA或蛋白质样品在凝胶上进行分离，使不同相对分子质量的分子在凝胶上展开，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到固相支持物（也就是滤膜）上。完成这个印迹过程以后，通过标记的探针与滤膜上的分子进行杂交，从而判断样品中是否有与探针同源的核酸分子或抗体反应的蛋白质分子，并推测其相对分子质量的大小。
最初设计的分子杂交是通过被称为Southern印迹转移的方式来检测DNA分子的，由于在操作方式上的相似性，通常将Western 杂交中的抗原反应也看作是分子杂交，抗体看作是探针，用于检测混合样中是否存在特异蛋白质及其相对分子质量。
4.4.1变性和复性
杂交过程涉及DNA变性。DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。DNA变性只涉及二级结构改变，变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，不伴随其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如热力、强酸、强碱、有机溶剂（如甲醛、甲醇、乙醇及甲酰胺）和尿素、变性剂、射线、机械力等均可引起核酸分子变性。RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。
变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：①溶液黏度降低。DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构，DNA黏度因此而明显下降。②溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的结构改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。③增色效应。监测DNA是否变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸光度变化。DNA变性时，DNA在260nm处的吸光度增加，这种现象叫做DNA的增色效应。因为DNA未变性时，DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。
将温度降低，变性的两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性（renealing）。复性是一个缓慢的过程，因为在溶液中，互补的单链首先必须找到对方，然后以合适的取向形成碱基对。一旦形成一段短的双螺旋DNA区，其余的DNA通过紧扣机制可以快速复性。核酸复性时，紫外吸收降低，由于核酸复性而引起紫外吸收降低的现象，称为减色效应。
DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。相对分子质量越大，复性越难；浓度越大，复性越容易。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。
4.4.2探针与探针的制备
在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交，但首先要有一段与目的核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。用作检测的核酸片段即为探针。
探针是用来检测某一核酸分子是否存在的工具，可以是DNA、RNA或寡核苷酸，可以是单链也可以是双链（双链在使用前要变性成为单链状态）。任何一个具有一定长度的核酸分子都可用作探针，但在使用之前必须进行标记。探针的标记可分为直接标记和间接标记。对核酸的标记最常用的标记物是放射性同位素，如32P、33P、35S，可检测出1～10μg 高等生物基因组DNA中的单拷贝序列，但存在半衰期短和污染环境等缺点。近年来发展了一些非放射性标记物，如生物素、地高辛和荧光素等，已在国内外推广应用，取得较理想的结果。但是直到目前，仍然没有任何一种标记物可以完全代替放射性核素在核酸分子杂交中的地位。放射性同位素标记核酸探针一般是用酶促法将含有放射性同位素的核苷酸掺入到新合成的核酸链中，或将放射性同位素的原子转移到核酸链5′末端或3′末端。其标记方法如下：
1.均匀标记
对探针DNA进行标记时，有时需要复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸（如［α32P］dATP），从而使整个新分子被均匀地标记，这种标记亦称均匀标记。其显着特点是探针分子的标记不局限在一个位点上，标记物与探针分子的摩尔比远远大于1，在有的标记方式中探针分子还得到了扩展。因此，均匀标记可使探针的标记信号扩大，得到高比活度的探针。
（1）切口平移标记 这种标记方式目前只有通过大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ来完成，因为只有该酶具有5′→3′外切酶活性。通过在待标记的DNA分子上产生切口，该酶引发5′→3′外切反应，在随后的5′→3′DNA聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷（dNTP），如［α32P］dATP，新合成的核酸链就带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记DNA分子的任何一条链中的任何位点（除靠近5′端外）都可能作为标记的起始点，并持续到该链的3′末端。因此，新合成的被标记的分子可以代表该待标记DNA分子的绝大部分核苷酸序列。
切口平移法可产生高比活性的DNA探针，人们常用此法来制备特定序列的探针，用于检测基因文库、基因组DNA斑点和RNA斑点。任何形式的双链DNA都可进行缺口转移标记。缺口转移所标记的DNA，平均大小为600个核苷酸，30%～60%的dNTP 被催化到DNA链上。
获得理想的缺口平移标记效果，对DNase Ⅰ酶活性的控制是至关重要的。缺口太少会导致标记不足，缺口太多又会使DNA标记片段太小，从而影响使用。可通过调整DNase Ⅰ的浓度来控制缺口的密度，从而得到高比活性探针或低比活性的高相对分子质量探针，在理想条件下，14～15min内，约30%～40%标记在核苷酸序列DNA上。
（2）随机引物标记 利用由6个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在Klenow 酶的作用下对待标记DNA进行随机扩增。这样扩增出来的DNA产物包括从任意某个位点（可能最靠近5′的一些核苷酸除外）起始的单链DNA片段，产物群体包含了目的DNA所有核苷酸序列信息。在扩增中加入标记的dNTP，扩增出来的DNA产物就可用作探针。随机引物法是一种非常简单并能重复的方法，通常用1～5ng 单链或双链DNA来标记，标记DNA的比活性至少可达2× 109dpm/μg。该方法多用来标记DNA片段。
（3）PCR扩增标记 在PCR扩增时加入标记的dNTP，不仅能对探针DNA进行标记，还可进行大量扩增，尤其适用于探针DNA浓度很低的情形。
（4）单链探针 单链核酸探针仅由特定核苷酸序列的某一条链组成，而不像传统的探针为双链分子。由于不存在双链互补，因此可以消除探针的两条链在杂交过程中形成无效双链的可能性，从而增加探针与靶序列之间形成杂合体的稳定性，提高检测的灵敏度。①单链DNA探针。单链DNA探针是通过单链模板来制备的。首先将待标记的双链DNA连接到M13噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链DNA。然后以单链DNA为模板，以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在标记的dNTP 存在下，通过Klenow DNA聚合成单链DNA，经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链DNA探针。②单链RNA探针。在有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子，例如pGEM 3和pBlueⅡ系列载体分别含有T7/SP6噬菌体启动子和T7/T3噬菌体启动子。将待标记的DNA片段插入载体的多克隆位点，相当于在该片段的两端各连接了一个噬菌体启动子。
