选择要使用的启动子,从而决定要转录哪一条链。在转录区下游选择一个酶切位点,用限制性内切酶将载体线性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体RNA聚合酶、NTP和某个标记的NTP在体外进行转录,合成出标记的单链RNA。利用无RNA酶活性的DNA酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链RNA探针。单链RNA探针的制备不仅比单链DNA探针更容易,而且其产生的杂交信号更强。
2.末端标记
直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子,或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物,这种直接标记一般是在探针分子的末端进行,亦称末端标记。经末端标记的核酸分子除了用作分子杂交的探针外,更多地用于RNA的S1核酸酶作图,以及用作引物延伸反应中的标记引物和凝胶电泳中的相对分子质量标准。
(1)DNA片段的末端标记 末端标记主要通过酶促反应来完成,但标记的方式很多。如Klenow DNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在对DNA片段进行末端补平反应或平末端的置换反应时可引入标记的核苷酸,T4多核苷酸激酶可以在DNA的5′末端引入标记的磷酸基团或将5′末端的磷酸基团用标记的磷酸基团置换,末端转移酶可以使DNA的3′末端连接标记的核苷酸。
(2)寡核苷酸的标记 合成的寡核苷酸主要通过T4多核苷酸激酶在5′末端引入标记的磷酸基团进行标记,也可利用末端转移酶在3′末端连接标记的核苷酸。如果想提高标记物的比活度,也可利用Klenow DNA聚合酶做引物延伸反应,用合成的更短的寡核苷酸作引物或合成两个部分互补的寡核苷酸使之互为引物互为模板,在DNA合成过程中引入标记的核苷酸。
在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素,如32P、33P 和35S。32P的半衰期较短,为14.3d,其放射性粒子的穿透力较强;33P 的半衰期较长,为25.4d,穿透力较弱,产生信号不如32P 强。在掺入核苷酸的标记过程中,只有三磷酸核苷的α位磷酸整合到核酸链中,因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷,如[α32P]dATP。而在标记5′末端磷酸基团的反应中使用γ 位磷酸被标记的ATP。放射性的信号通过X 光片放射自显影或磷屏扫描获取。
非放射性标记物应用最成功的是Roche 公司(原德国宝灵曼公司)开发的地高辛(digoxygenin,DIG)标记核酸探针。将DIG 与dUTP 交联,在掺入核苷酸的标记反应中用DIG 11dUTP(或DIG 11UTP)取代dTTP(TTP),使探针DNA或RNA分子被DIG 标记。DIG标记的检测是该技术的核心,即利用抗DIG的抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗DIG 的抗体与碱性磷酸酶偶联,通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目的核酸分子处,在加入显色剂BCIP/NBT(5溴4氯3吲哚磷酸盐/盐酸氮蓝四唑)后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀,从而显示出目的分子的有无和位置。除了地高辛和碱性磷酸酶外,还有其他的标记配基和偶合酶,如生物素和辣根过氧化物酶等。另外,这些偶合酶也可催化某些化合物的化学发光反应,通过X 光片或磷屏扫描获取发光信号。
非放射性核酸探针的标记方法主要包括酶促标记法和化学标记法。生物素和地高辛标记的dNTP 可以与放射性核素标记的dNTP 一样,用多种酶促方法(例如缺口平移法、随机引物法及末端转移酶末端标记法等)进行探针(包括DNA、RNA及寡核苷酸探针)的标记。由于生物素等标记物是连接在碱基上而不是在磷酸基团上,因此不能用多核苷酸激酶法进行末端标记。化学标记法是利用标记物分子上的活性基团与待标记的核酸分子上的基团发生化学反应,从而将标记物直接结合到核酸分子上。
非放射性标记在使用过程中不仅安全,而且使用方便、标记的探针可保存并可重复使用、便于控制显色反应、显色后的杂交膜可长期保存、杂交信号的灰度明显(特别是在菌落杂交中易于辨别真假阳性)。但其检测灵敏度不够高,而且杂交膜不易二次或多次杂交。
在Western 杂交中,一般不直接标记针对目的蛋白的特异性抗体,而是采用二次免疫的方式标记二级抗体,即标记抗特异性抗体的抗体。早期的研究工作中一般采用125I 标记抗体,但由于125I 的半衰期很长(60d),危险性很大,现在已被非放射性标记取代。其标记方式与核酸的非放射性标记类似,主要用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶与抗抗体偶联,再与显色剂BCIP/NBT 或二氨基联苯胺(DAB)反应形成有色沉淀,或催化发光反应。
4.4.3Southern杂交
Southern杂交是由Southern等人于1977年发明的一种检测DNA分子的一种方法,通过Southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上,然后进行分子杂交,在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。Southern杂交包括下列步骤:
①酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。②将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。③预杂交滤膜,掩盖滤膜上的非特异性位点。
④让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。⑤通过X 光片放射自显影或磷屏扫描获取目的DNA所在的位置。
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。
在最佳条件下,放射自显影曝光数天后,Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg 与32P 标记的高比活性( > 109cpm/μg)探针的互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上,并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
1.毛细管转移
在核酸杂交发展的初期,采用的转移方法是毛细管转移法。它是利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上。核酸转移的速率主要取决于核酸片段的大小、凝胶的厚度。一般来说,DNA片段越小,凝胶越薄,浓度越低,转移的速率也就越快。传统的毛细管转移法采用的是液流向上的方法:DNA片段由液流携带而从凝胶转移并聚集于固相支持物表面,液体通过毛细管作用抽吸过凝胶,借助一叠干燥的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速率取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度,小片段DNA(<1kb)在1h 内就能从0.7%的琼脂糖上全部定量转移,大片段转移较慢且效率较低。例如,大于15kb的DNA的毛细管转移至少要进行18h,并且18h 后转移仍不完全。在这种方法中,吸水纸及其上面重物的质量会压紧凝胶而降低核酸转移的效率,因而近年来发展了一种液流向下的毛细管转移法,即DNA片段由向下的碱性缓冲液液流携带转移并聚集于带电荷的尼龙膜表面,可以克服这个毛病,极大地提高了转移效率,且杂交信号也提高约30%。
2.电泳转移
将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。核酸完全转移所需时间取决于核酸片段的大小、凝胶孔隙以及外加电场的强度,一般约需2~3h,至多6~8h 即可完成,特别是对于不适合毛细管转移的聚丙烯酰胺凝胶中的核酸以及大片段核酸的转移更为适宜。
电转移过程中,电流比较大,将导致转移系统的温度升高,因此在进行电转移时,应采取一定的冷却措施。电转移法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。
3.真空转移
真空转移是利用真空作用将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空中,同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的杂交膜上。目前有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30min 内就能从正常厚度(4~5mm)和正常琼脂糖浓度( < 1%)的凝胶中定量地转移出来,而且转移后得到的杂交信号比Southern转移强2~3倍。缺点是如不小心,会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时,其背景比毛细管转移要高。
为了保证Southern杂交过程的顺利进行,需要根据实验目的决定酶切DNA的量。一般地,Southern杂交每一个电泳通道需要10~30μg的DNA。对于哺乳动物基因组DNA的Southern分析,当用于检测单拷贝序列的探针为标准长度(>500bp)时,凝胶每一加样孔应加10μg DNA样品。如果样品中目的序列含量很高,可以按比例减少DNA用量。
影响Southern杂交实验的因素很多,主要有:DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。另外,要取得好的转移和杂交效果,应根据DNA分子的大小,适当调整变性时间。对于相对分子质量较大的DNA片段(大于15kb),可在变性前用0.2mol/L HCl预处理10min 使其脱嘌呤。转移用的NC 膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透,否则会影响转膜效果;不可用手触摸NC 膜,否则影响DNA的转移及与膜的结合。毛细管转移核酸时,凝胶的四周用Parafilm膜围绕凝胶周边,防止在转移过程中产生短路,影响转移效率:同时注意NC 膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡,以免影响转移。杂交膜上出现斑点可能是由于封闭液中封闭剂浓度过低或封闭缓冲液配制时间过长,不能封闭杂交膜上的非特异性位点。此外,还应注意同位素的安全使用。
4.4.4Northern杂交
1977年,Alwine等提出了一种用于分析细胞总RNA或含poly(A)尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术,即Northern杂交技术。Northern杂交自出现以来,已得到广泛应用,成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似,Northern 杂交也采用琼脂糖凝胶电泳法,将相对分子质量大小不同的RNA分离开来,随后将其原位转移到固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,再用放射性(或非放射性)标记的DNA探针或RNA探针,依据其同源性进行杂交,最后进行放射自显影(或进行其他探针标记物的检测)。以目标RNA所在位置表示其相对分子质量的大小,而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度)。但与Southern杂交不同的是:总RNA不需要进行酶切,即是以单个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;电泳是在变性的条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离;点样前,也需要用羟甲基汞、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2′羟基基团。
Northern 杂交主要用来检测细胞组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子,从而判断在转录水平上某基因是否表达,在有合适对照的情况下,通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。
在Northern 杂交过程中的注意事项主要有以下几点:
(1)如果琼脂糖浓度高于1%,或凝胶厚度大于0.5cm,或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L NaOH溶液浸泡凝胶20min,部分水解RNA并提高转移效率。浸泡后用经DEPC 处理的水淋洗凝胶,并用20×SSC 浸泡凝胶45min,然后再转移到滤膜上。
(2)如果滤膜上含有乙醛酰RNA,杂交前需用20mmol/L Tris·HCl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)含甲醛的凝胶在RNA转移前需用经DEPC 处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意,有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力,需用7.5mmol/L NaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰RNA,同时可部分水解RNA,并提高较长RNA分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外,碱可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰RNA在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按DNA转移的方法进行,但转移缓冲液为7.5mmol/L NaOH溶液,转移结束后(4.5~6.0h),尼龙膜需用2× SSC、0.1%SDS 淋洗片刻,于室温晾干。