Gal4蛋白含有881个氨基酸，是一个转录因子。其1～147位氨基酸是结合功能域，第771～881位氨基酸是转录激活功能域。当两者靠近时表现转录活性功能，如果把两者分开，则丧失转录活性功能。激活功能的存在可用报告基因予以检测。现在常用的酵母双杂交体系中把BD 和AD 部分的DNA分别与两个待测蛋白质的编码基因DNA连接在一起，形成一个重组融合表达质粒，即BD X 和另一个AD Y。当这两个质粒被转化到同一个酵母细胞中并表达时，所产生的两个融合蛋白质中的X 和Y 部分如果有相互作用，则使得和它们连在一起的BD 和AD 相互靠近，转录活性得以显示；如果这个X 与Y 蛋白质之间并无相互作用，则不表现转录活性。转录活性的检测可用1个或几个报告基因，采用多个报告基因是为了增加结果的可信度，减少假阳性产生。常用的报告基因有His3和lacZ等。
酵母双杂交系统是通过激活报道基因来表达探测蛋白和蛋白的相互作用。主要有两类载体：一类是含DNAbinding domain的载体；另一类是含DNAactivating domain 的载体。
上述两类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4bd具有核定位序列（nuclear localization sequence），而GAL4ad 没有。因此，在GAL4ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T 抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用的binding domain 基因有GAL4（1～147）和LexA （E.coli 转录抑制因子）的DNAbd 编码序列。常用的activating domain 基因有GAL4（768～881）和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：易于转化、便于回收扩增质粒。具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。酵母的内源性蛋白不易与来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域（如GAL4bd，LexA bd）；另一个基因融合到转录激活结构域（如GAL4ad，VP16）。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的基因表达（如lacZ），从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X Gal 及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交系统的最主要应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：①作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。②检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。③检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。④酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交系统也有其局限性，主要问题有：①双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工，如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。②酵母双杂交系统的一个重要问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。
4.6.2酵母单杂交技术
酵母单杂技术是1993年从酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子的参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域和转录激活结构域。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点（UAS），而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID 相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
基本操作过程为：①设计含目的基因（称为诱饵）和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中； ②将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中；③若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里，作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究，应用该技术成功筛选出乙型肝炎病毒表面抗原启动子SP Ⅰ的结合蛋白。
4.6.3噬菌体展示技术
噬菌体属于单链DNA病毒，其DNA长约7000bp，基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示技术相关的是结构蛋白p Ⅲ和p Ⅷ。p Ⅷ 前体由73个氨基酸残基组成，其中信号肽为23个残基，根据构成外壳的功能可分四个区，6～24氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部，25～35氨基酸残基区域具有高度疏水性，C 端与DNA相结合，构成完整的内壁，N 端为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置。p Ⅲ前体由424个氨基酸残基组成，位于噬菌体的尾部，由四个功能区组成，即信号肽区、受体结合区、C端的疏水区及穿膜区，穿膜区是最外露的区域，是插入外源基因的最佳位置。噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术。
其操作过程为：以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，如在噬菌p Ⅲ和p Ⅷ衣壳蛋白基因区的N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体的表面，不影响噬菌体的生活周期及天然构型，且易被相应的抗体或受体分子识别，外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固相支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体（即亲和富集法），选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序得知。在这一过程中，外源基因是编码启动子DNA结合蛋白的文库基因，而固定或固相支持物分子则为启动子DNA片段。
噬菌体展示技术是一种经济高效的研究生物大分子相互作用的技术，如构建噬菌体随机多肽文库可用来筛选包括抗体、小分子、细胞表面受体等多种分子。
4.6.4DNA迁移率变动试验
DNA迁移率变动试验（DNAmobility shift assay），又叫凝胶阻滞试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。其基本原理是在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白。将该实验改进，DNA与更多的蛋白结合，移动速度进一步减慢，这种方法又称超级迁移率变动试验（supershift assay）。由于其特异性好，DNA迁移率变动试验常用来鉴定用其他方法筛选出的结果。
