4.6.5DNase Ⅰ足迹试验
足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多，常用的有DNase Ⅰ足迹试验、硫酸二甲酯足迹试验（dimethylsulfate，DMS），两者原理基本相同。
DNase Ⅰ足迹试验的原理为：蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。
操作技术流程为：待检双链DNA分子用32P 作末端标记，通常只标记一端；蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNase Ⅰ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设立未加蛋白质的对照组；从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。足迹试验特异性好，定位精确，使用广泛。
4.7通路克隆-Gateway 技术
Gateway 技术能够克隆一个或多个基因进入任何蛋白表达系统。这项强大的体外技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便地穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway 也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
Gateway 克隆技术的基础是lambda 噬菌体的位点特异性重组反应，一种准确保存遗传信息的有效的自然的生化途径。与传统的需要DNA限制性内切酶、DNA连接酶、凝胶电泳和DNA片段纯化等多个步骤的亚克隆方法相比，该方法只需一步生化反应，而且操作方便、快捷，节省了大量的时间和劳力。
Gateway通路克隆技术是重组酶（λ整合酶）催化的位点特异的重组反应，由LR 和BP 两个反应组成，可简单表示为：attB×attP← →attL×attR。重组位点attL、attR、attB和attP由λ噬菌体和大肠杆菌编码的克隆酶合剂特异识别，双载体发生融合后，分解出新的质粒表达载体。
BP 反应利用一个attB DNA片段或表达克隆与一个attP 供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway 目的载体进行有效重组。通用M13位点便于测序。基于pUC的ori位点可提供高产量质粒。构建入门载体可以有多种选择：①限制性内切酶消化。
作为PCR克隆的替代方法，有一些入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。此外，有些载体提供了SD（Shine‐Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效地翻译。
②PCR重组克隆。重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB 位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增PCR产物和入门载体及BP酶混合物，接着转化进大肠杆菌中而获得包含目的基因的入门重组载体，同时目的基因两侧具有attL 重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway 目的载体进行重组。
4.8RNA干扰技术
1998年，Fire等利用双链RNA特异抑制了线虫体内特定基因的表达。在线虫体内，少量特异双链RNA分子（通常在纳摩尔浓度水平）即可导致细胞中全部同源RNA转录物的降解。
Fire等由此第一次提出了RNA干扰的新概念。此技术可追溯到1990年在植物中发现的转录后基因沉默等现象，这使此技术找到了天然的源头和理论依据。因此该技术一经提出，即受到广泛关注，很快RNA干扰技术同样在哺乳动物细胞中取得成功。2001年，发现了长度在30核苷酸以下的短双链小分子干扰RNA，它比以前使用的长双链RNA干扰技术有更高的专一性和更小的不良反应。从此，siRNA技术得到了广泛应用，RNAi 与siRNA技术得到了突飞猛进的发展。
4.8.1siRNA干扰机理
在siRNA技术中，siRNA首先与多种蛋白质形成RNA诱导的沉默复合物（RNAinduced silencing complex，RISC）。然后在RISC 中，蛋白复合物使siRNA解链，形成单链RNA蛋白复合物中间体，在单链RNA的指导下，使RISC 结合到mRNA的靶位点上，然后由RISC 复合物中类似核酸酸样的蛋白质结构域降解mRNA。
siRNA的设计中主要注意事项是：①内部不能含大量的G/C，以G/C 含量在30%～50%为好；②3′端5个核苷酸中A/U 对多的有利于反义链进入RISC 复合物；③单链siRNA能形成发夹环，降低了siRNA的有效浓度和沉默的效率；④第10个核苷酸为A 的有利于RISC 对靶RNA的剪切等；现在有一些siRNA的设计软件帮助进行siRNA的设计。
但现在按所有siRNA设计说明规则设计的序列，也仅约50%的序列可以有效剪切靶RNA或抑制靶RNA的表达。还有许多目前尚不清楚的因素影响siRNA的作用，如mRNA翻译状态可能影响RISC与靶RNA的结合。
4.8.2siRNA的合成
siRNA的来源主要分为体外合成途径与体内表达途径。体外合成法合成的siRNA，不需依靠各种载体的帮助，可以直接导入体内。它又可分为化学合成与体外转录途径。所有DNA合成仪均可合成RNA，所需的是改用RNA合成软件和RNA合成试剂。因此，RNA的化学合成可以与DNA合成一样做到自动化，有方便、准确的特点。
现在有多种依赖于DNA的RNA聚合酶可进行siRNA的合成。不同的聚合酶对合成物5′端的序列有一定的要求，如T7RNA聚合酶需要siRNA5′序列为GGG，而P6和T3RNA聚合酶则可合成5′端为A 的siRNA。按模板的不同又可分为线性质粒的转录、双链合成模板的转录和单链合成模板的转录。在现有条件下，双链合成模板的转录最经济，也最快捷。
4.8.3细胞和整体生物导入siRNA的方法
有多种导入siRNA的方法，不同的生物体采用不同的导入方法。细胞中导入siRNA的方法主要用脂质体包裹siRNA表达载体，将siRNA基因导入细胞，也可用脂质体包裹合成的siRNA导入细胞。对线虫可以用浸泡、注射和喂食的方法导入siRNA。植物只能用农杆菌载体，结合愈伤组织培养的方法导入。最方便的导入哺乳动物的方法是直接注射法，可以在需要抑制基因表达的部位，直接注射含siRNA基因的病毒载体或细胞内表达的载体。可用的病毒载体有腺病毒载体、腺病毒辅助病毒载体、蔓病毒载体等。真正用于临床的方法，必须在合适的时间，将siRNA送到合适的组织和合适的细胞，尽量消除非序列特异的作用（包括免疫作用）。
本章小结
本章详细介绍了基因工程的一些基本操作技术，包括核酸的提取与纯化、检测与保存以及核酸分子杂交技术等。
基因工程的主要操作对象就是DNA，不同生物（微生物、植物和动物）基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织其细胞结构及所含的组分不同，分离方法也有差异。一般来说，细菌细胞有坚硬的细胞壁，因此必须除去细胞壁才能把细胞内容物释放出来，一般采用机械或酶法处理。动物细胞没有细胞壁，因此只用温和的去离子剂溶解细胞膜。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。作为遗传物质的DNA，除细胞核DNA外，在植物中还有线粒体DNA和叶绿体DNA，动物中有线粒体DNA，细菌中有质粒DNA。
检测核酸的方法主要有紫外光谱分析法、EB 荧光分析法和琼脂糖电泳。其中最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖电泳。RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛二甲亚砜（DMSO）。对于小相对分子质量的RNA、寡核苷酸和DNA序列等，一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其变性条件常采用加热或加入尿素等变性剂。
分子杂交根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern 杂交和Western杂交等。在分子杂交过程中，都采用了印迹转移技术，都是先将DNA或RNA或蛋白质样品在凝胶上进行分离，然后将凝胶上的样品通过影印的方式转移到固相支持物上。通过标记的探针与固相支持物上的分子进行杂交，从而判断样品中是否有与探针同源的核酸分子或抗体反应的蛋白质分子，并推测其相对分子质量的大小。
在核酸序列分析技术中，有化学法、酶法和自动化测序等方法。在核酸和蛋白互作研究技术中，有酵母双杂交和酵母单杂交、Gate 重组技术、RNA干扰技术等。
思考题
1.你在做Southern印迹分析实验，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。但为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上，然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。
错在哪里？
2.切口平移标记探针的主要步骤有哪些？
3.什么是Western 印迹？ 它与Southern印迹有什么不同？
4.建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？
（王兰、邹克琴）
