若在操作中采用热启动方式或在PCR扩增程序设计上运用退火温度降落方式（touch downPCR），可以减少引物二聚体的生成。另一方面，PCR扩增退火温度常根据较低的Tm 值选定，故3′端引物与5′端引物应有相接近的Tm 值，其差别不应大于5℃，否则难以保证扩增的效果。
（5）引物末端修饰。在PCR扩增中，引物的3′端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，不能进行任何修饰。引物的5′端并无严格的限制，在与模板结合的引物长度足够的前提下，其5′端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些游离序列对引物与模板的结合并无显着影响，因此引物的5′端可以被修饰，如引入突变位点，用生物素、荧光素、地高辛等化学物质标记，引入蛋白质结合DNA序列，添加限制性酶酶切位点序列便于扩增产物的下一步克隆等。
2.引物3′端的末位碱基
引物3′端的末位碱基对TaqDNA聚合酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配概率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3′端使用碱基A。当末位碱基为T 时，在错配的情况下也能引发链的合成，所以也应尽量避免在引物的3′端第一位碱基使用T。引物3′端末位碱基最佳选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。
3.引物设计软件
引物的设计要考虑多方面的因素，设计出的引物在PCR扩增中具有重要的地位，直接关系到靶DNA片断能否扩出，扩出的效率有多高，是否存在非特异扩增现象等，因此要进行科学的设计。引物的设计通常通过有关设计软件得以完成。目前常用的专门设计软件主要包括“Oligo”和“Primer Premier”，它们均具有引物的自动搜索功能和引物分析评价功能，但两者侧重点不同，“Primer Premier”自动搜索功能最强且方便使用。除了上述两种设计软件外，“Dnassist”、“Omiga”和“DNAstar”都可以用于引物设计。随着国际互联网的普及与发展，很多大型生物技术公司提供的网络在线引物设计平台，如Invitrogen公司、Roche公司等网站均提供在线引物设计。
5.2聚合酶链反应技术类型
PCR技术从1985年建立以来，在过去的20多年里发展极快，从早期的简单扩增发展为一系列的技术体系，不仅可以扩增两段已知序列间的DNA，现在发展到可以扩增已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增序列未知的新基因，衍生出的方法达到几十种，并且还在不断发展、完善，功能上不仅可以用于DNA的单纯扩增，还可以用于DNA的定点突变，基因的定量和基因的连接等。
5.2.1已知DNA序列的聚合酶链反应扩增
对已知DNA序列的体外酶促扩增，是PCR的最初功能。作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片断，应知道其全序列或其两端20～30bp 的核苷酸序列以供设计3′端、5′端引物之用。靶DNA可以是环状DNA分子的一部分，也可以是线型DNA分子的一部分。按照PCR的原理与操作要求，在冰上分别把人工合成的一对特异引物、提取或分离的靶DNA、dNTP、Mg2＋、PCR反应缓冲液、耐热DNA聚合酶等按一定的浓度或量要求添加到反应管中，混合后置于PCR仪中，设定变性、退火、延伸三步反应的温度与时间及循环次数，编好反应程序并运行。但在有些情况下，若引物的退火温度与DNA聚合酶的酶催化活性温度相近，则可以把退火与延伸两步过程合二为一，只需使延伸时间稍微延长即可，使PCR扩增程序更为简单。扩增结束后取适量产物通过凝胶电泳即可鉴定扩增的效果。对于此类已知DNA序列的PCR扩增，经常用于重组子的鉴定、微生物类型鉴定、亲子鉴定等方面。
5.2.2逆转录聚合酶链反应
PCR技术不仅可以用于DNA靶序列的扩增，也可以用于RNA靶序列的扩增。RNA水平的PCR通常称为逆转录聚合酶链反应（reverse tranion‐polymerase chain reaction，RT‐PCR），有时也称为反转录PCR、RNAPCR，它是一种将mRNA反转录与PCR技术相偶联的靶基因分离技术。通过mRNA反转录得到对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，获得大量的靶DNA序列。反转录可以用总RNA或分离出的总poly（A）RNA为模板进行，反转录产物无需转变成双链cDNA即可进行PCR扩增。RT‐PCR为经cDNA分离特定表达基因提供一种通用、便捷的手段。
常见的RT‐PCR可以分为一步法和两步法两种类型。一步法是RT 和PCR过程在同一反应管和单一的反应缓冲液中完成，RT 完成后不需打开反应管进行加样以避免污染。两步法是先在一个管中通过反转录酶的作用将mRNA模板反转录出cDNA一链，再在另一个管中添加适量已反转录获得的cDNA一链，加入特异引物及其他反应成分后进行PCR扩增。
两步法虽然在操作上比较繁琐，但可将反转录产物分别进行多种不同的PCR反应，可以从一个样品解答多个问题。
逆转录中所用的引物可以是基因特异引物，也可以是oligo（dT）或随机引物。用特异引物即用3′端引物通过与mRNA模板结合引导反转录只能获得特定基因或基因家族的cDNA序列，而oligo（dT）引物则是针对真核生物mRNA在3′端均带有poly（A）结构设计出来的，它能指导体系中所有的3′端带poly（A）尾巴的mRNA反转录为cDNA，不会对总RNA中的rRNA进行反转录。但是在反转录过程中若使用随机引物，如果用总RNA为模板，则反转录得到的产物中除了由mRNA反转录出的cDNA外，大部分产物均为总RNA中的rRNA反转录产物。至于实验中选择何种反转录引物，则视具体需要而定。
反转录常用的逆转录酶主要有三种类型，第一类包括Moloney 鼠白血病病毒来源的MMLV 反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒来源的AMV。这两种酶在反转录过程中，均缺乏3′→5′的核酸外切酶活性，因此没有校正功能，而且在反转录体系中需要高浓度的dNTP 以确保反转录完全。在反转录酶活性最适温度方面，MMLV 反转录酶活性最适反应温度为37℃，比AMV 反转录酶的活性最适反应温度低，不利于具有强二级结构的RNA的反转录。对于这两种酶的RNase H 活性方面，AMV 的RNase H 活性较MMLV 的高，故AMV 在反转录过程中更易发生消化反转录产生的RNA‐DNA杂合链中的RNA部分，也能消化cDNA链3′端的RNA模板，限制了cDNA合成的长度。第二类反转录酶是MMLV反转录酶的RNase H突变体，具有反转录效率高、合成的cDNA更长的特点，而且可在更高的温度（如50℃）下反转录合成cDNA，更有利于具有强二级结构的RNA的反转录。第三类是前面提到过的嗜热热稳定的TthDNA聚合酶，在Mn2＋存在下表现反转录活性，可以实现RT 与PCR一步操作，但合成的cDNA长度低，保真度降低。
5.2.3已知cDNA一段序列获得全长cDNA的聚合酶链反应
cDNA是基因转录产物mRNA通过反转录而来的。除了上述通过反转录途径获得cDNA外，cDNA序列还可以通过构建cDNA文库后筛选获得，也可以通过对分离纯化后的目的蛋白进行氨基酸序列测定后获得，但通常情况下获得的cDNA只是基因全长cDNA的部分序列而并非全长。cDNA末端的快速扩增（rapid amplification of cDNAends，RACE）为克隆获得基因全长提供了解决途径。RACE 是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点、扩增基因转录本未知区域、从而获得cDNA完整序列的方法。
根据待扩增序列与已知序列的位置关系，可分为3′RACE 和5′RACE，分别用于获得已知序列位点下游的mRNA未知序列和已知序列位点上游的mRNA未知序列。
1.3′RACE
3′RACE 扩增获得已知序列下游的mRNA未知序列，主要分为两步，第一步是通过反转录获得3′末端第一链cDNA序列，然后以第一链cDNA产物为模板以套式引物扩增出3′末端序列。根据大多数真核mRNA的3′端本身带有poly（A）尾巴，为mRNA3′序列反转录提供天然的引物互补退火位点，因此与一般的mRNA反转录相似，可以设计能与poly（A）互补的oligo（dT）序列作为反转录引物，经退火后引导cDNA链的合成。但为了方便后续的cDNA3′序列的扩增及提高实验结果的可靠性，需对3′RACE反转录引物两端做特殊设计。反转录引物5′端添加一特定序列，这特定序列由外侧引物区（outer primer，OP）和内侧引物区两部分组成，OP和IP将为以后的两轮PCR扩增提供引物序列。为了让反转录在紧接poly（A）尾巴交界处开始，降低扩增物中的同聚尾长度，在反转录引物的3′端加入一个非T 碱基的锚定核苷酸，构成3′锚定引物（anchoring primer，AP），它实为三种引物的混合体。
为了扩出未知序列，可根据目的基因的已知序列设计两条基因特异性引物GSP1（外侧基因特异性引物）和GSP2（内侧基因特异性引物）。在用反转录产物扩增目的序列时，先用GSP1和OP引物组合进行第一轮PCR扩增，然后用第一轮PCR扩增产物为模板，以内部套式引物即GSP2和IP 引物组合进行二次PCR扩增，以提高扩增产物的特异性。
2.5′RACE
5′RACE 用于扩增目的mRNA已知序列上游（即5′端）的未知序列。由于mRNA的5′端没有类似于3′端的寡聚核苷酸尾巴，为此需要设计一种能够将锚定引物AP 序列引入其cDNA的方法，然后通过类似3′RACE 的巢式扩增获得5′端未知序列。经典的5′RACE 是先通过序列已知的GSP1作为反转录引物产生cDNA第一链，去除杂合链中的RNA后利用DNA末端转移酶的活力对cDNA第一链进行同聚核苷酸加尾，在生成第二链cDNA时引入锚定引物序列，再按3′RACE 的方法扩增出目的序列。
此经典的5′RACE 遇到的问题是由于序列本身的结构特征和反转录酶的持续能力等原因，反转录反应并不能使所有得到的第一链cDNA到达末端，形成一些假全长cDNA片断，但末端转移酶不能区分这些假全长片断与真全长片断，可同时对它们有效地加尾。为了克服上述问题而发展出的新5′RACE 技术采用在反转录前先对5′端完整mRNA脱帽子结构，然后在RNA连接酶的作用下把锚定RNA寡核苷酸引物序列连接到mRNA的5′端。反转录时，只有那些进行到mRNA5′末端的反应（即反转录反应能够进行到mRNA5′端锚定序列），互补序列才会整合进第一链cDNA的3′端，在以后的PCR扩增中，由于以锚定序列作为引物，只有那些全长的cDNA才能被有效扩增。
研究中发现，某些反转录酶在反转录到达RNA末端时，会表现出末端转移酶的活性而将3～5个脱氧核苷酸残基（主要是dC）添加到第一链cDNA的末端，而且只有到达末端时才显示这种活性，因此可以设计出3′端带3～5个dG 的锚定引物加入到反转录体系中，该含poly（dG）的锚定引物可结合RNA反转录到末端时已添加poly（dC）的第一链cDNA3′端序列上。
通过此技术同样可以扩出mRNA的5′端全长序列。
5.2.4已知序列侧翼聚合酶链反应扩增
常规的PCR技术是用于扩增两段已知序列之间的DNA片断，而对于已知序列侧翼的未知DNA序列的扩增，常规的PCR则显得无能为力。后来，科学家在常规PCR的基础上发明了获得已知序列基因两侧未知DNA序列的PCR方法，包括反向PCR、锚定PCR、TAIL‐PCR等，大大方便了对已知序列的侧翼未知DNA的扩增。
