1.反向PCR
反向PCR（inverse polymerase chain reaction，IPCR）非常适合于已知序列侧翼DNA序列的扩增，虽然在设计扩增用的一对引物时与常规PCR引物设计的规则一致，设计出的引物必须与已知序列互补，但与常规PCR引物的方向是相对的不同，用于反向PCR的一对引物方向是相反的。用这样的一对引物做常规的PCR扩增，每个引物只能对各自的模板线性扩增，不能进行指数级增长，无法得到足够的产物。故用IPCR扩增的DNA模板必须先经过某种限制性内切酶酶切后，然后通过连接使含有已知序列的DNA环化，使设计的引物由原来的相反转变为相对，就按常规PCR操作扩出未知的侧翼序列。所以综合来讲，IPCR主要包括酶切、切出片断自身连接环化、PCR扩增等步骤。
首先，用限制性内切酶消化待测线性DNA模板。其次，用连接酶将酶切后的线性DNA模板自身连接成为环状分子，从而使引物处于一个相对的位置。最后，可以通过两种方式进行未知序列的扩增：第一为用设计的引物直接进行常规PCR扩增；第二为先把已环化的DNA用另一种限制性内切酶消化，将环状DNA从已知区域中间切开，这样线性化的DNA两侧为已知序列，未知序列夹在中间，再按常规PCR进行扩增。
通过上述技术处理，就能获得已知序列的侧翼未知序列。为了提高扩增产物的特异性，往往设计巢式引物（nested primer），即包括内侧引物、外侧引物共两对引物，先用外侧引物对样品进行一次扩增，然后用内侧引物对一次扩增产物进行二次扩增，扩出的特异序列通过序列测序与分析，就可获得侧翼序列。
2.锚定PCR（anchored PCR）
锚定PCR又称单侧特异引物PCR（single‐specific primer PCR，SSP‐PCR），是指通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。在锚定PCR中，一条引物为根据已知序列设计的序列特异性引物，另一条则是根据序列的共同特征设计的非特异性引物。
这种非特异性的通用引物起到在其中一端附着的作用，故称为锚定引物，与锚定引物结合的序列则称为锚定序列。一种常用的锚定PCR技术是以DNA文库中载体上的一小段序列作为锚定序列。还可把通过人工合成的特定序列连接到DNA片断上作为锚定序列，因此可称为连接锚定PCR（ligation anchored PCR）。在前述的RACE 技术扩增基因中，均属锚定PCR范畴，用到的同聚物即为锚定引物，包括根据成熟mRNA的poly（A）序列特征设计出的一段oligo（dT）引物，以及由mRNA通过反转录获得的一链cDNA通过DNA末端转移酶在其3′末端进行同聚物加尾后，如poly（dG）尾，再据此尾特点而设计出的对应poly（dC）引物，它们均属锚定引物的范畴。关于RACE 技术这里不再重复。
3.TAIL‐PCR
交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL‐PCR）是利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物（arbitrary primer）引导扩增已知序列的侧翼序列的技术。它是一种半特异性的PCR反应，由于两类引物的退火温度不同，从而可以通过控制反应过程中的退火温度有效地控制特异性和非特异性产物的扩增。在TAIL‐PCR中序列特异性的巢式引物较长，退火温度较高，因此在PCR反应中退火温度的高低对它与目的序列的退火没有太大的影响，在高、低两种退火温度下都可以与已知序列发生特异性的退火，而序列短的任意引物则仅可以在退火温度较低时与未知序列（已知序列的侧翼序列）发生退火，通过高低温退火温度的交替进行，使目的基因得到有效的扩增。该PCR技术由我国科学家刘耀光教授发明，对于分析已知序列的侧翼序列非常有效，尤其适用于对转基因突变体T‐DNA插入位点侧翼序列的分析。为了提高扩增的效率和扩出更长的DNA片断以提供更多的侧翼序列信息，发明者对该技术进行了进一步的完善，在原来TAIL‐cycling 技术的基础上引入了抑制PCR技术，发展出了hiTAIL‐PCR方法。此新方法对已知序列位点的侧翼未知序列的分离显示了更强大的生命力。
5.2.5未知序列聚合酶链反应扩增
利用PCR技术扩增已知基因序列并不困难，只要根据基因的3′和5′两端序列合成一对引物就可实现，但对于用PCR扩增未知序列，因为不能设计所需要的引物而难以实现。随着PCR技术的发展，近年来先后发展了几种针对未知序列的PCR扩增技术，包括差异显示PCR、限制性显示PCR、消减PCR、简并PCR和Alu‐PCR等，非常适用于扩增差异表达的基因或新基因。下面重点对前三者作详细介绍。
1.差异显示PCR
在高等生物中，体内基因的表达图谱不仅随着发育时间与空间的变化而呈规律变化，也会在环境诱导或转基因等条件下，基因的表达图谱也会随之变化，因此分离、分析这些差异表达的基因非常有利于认识生物的基因功能及其表达规律。但传统的PCR方法难以分离这些差异显示的基因。1992年Liang 和Pardee 建立了一种全新的显示mRNA表达差异的方法，即mRNA差异显示PCR（mRNAdifferential display PCR，DD‐PCR）技术，又称差异显示反转录PCR（differential display reverse tranion PCR，DDRT‐PCR）。由于该技术具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点，已用于越来越多的差别表达基因的分离与鉴定，在分子生物学和基因工程领域发挥了极大的作用。
该技术的原理主要是基于真核生物成熟mRNA具有poly（A）尾巴结构的特点，根据在poly（A）上游的2个碱基只能有12种可能的排列组合：前面第一个碱基（B）有G、C、T三种可能，第二位碱基（N）有A、T、G、C四种可能，设计出oligo‐（dT）12MN 样mRNA3′端反转录锚定引物，它是由约12个连续的脱氧核苷酸加上两个3′端锚定脱氧核苷酸组成，其中M 为除T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N 则为任何一种核苷酸（即A、T、G 或C），故MN共有12种不同的排列组合方式，并用5′T12MN 表示，共有12种引物。用任何一种oligo‐（dT）12MN 对mRNA进行反转录，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA‐cDNA杂合分子。然后以一种由10个核苷酸组成的5′端随机引物（arbitrary primer，AP）和3′端锚定引物进行PCR，以获得足够的cDNA进行差别显示分析。若使用12种3′端锚定引物和20种5′端随机引物组成的全部240组引物对作PCR扩增，理论上能得到20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体上涵盖了在一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA种类。
为了便于显示不同样品按同一种引物对扩增后的差异表达带，常在PCR反应体系中加入放射性核素32P或35S以标记反应产物。PCR反应结束后各取适量产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影和对胶板上的不同样品间进行比较，找出差异显示条带。
将差异条带从凝胶上切割并回收cDNA，即可进行克隆测序分析或用作制备探针从基因文库中调取有关基因。该技术具有用样少、操作简易、快速高效和可同时对多种样品进行比较等优点，但在实际操作中还发现，该技术也存在一些不足，如若要检测全部mRNA种类则每样品要进行至少240次PCR并进行后续分析，样品越多工作量越大；受聚丙烯酰胺凝胶分辨能力的影响，有存在差异条带漏检的可能；有时条带集中使目的带难以准确切出，导致假阳性结果等。
2.限制性显示PCR
DDRT‐PCR技术的发展为差异表达基因或新基因的发现提供了有效的途径。由于使用了兼并性引物和特异性不高的锚定引物，扩增结果往往产生较高的假阳性现象，阻碍了该技术的发展应用。马文丽发展的限制性显示PCR（restrict display PCR，RD‐PCR）技术很好地解决了上述问题。
RD‐PCR的原理是将反转录的cDNA或双链DNA分子，经限制性内切酶酶解后连接上互补的接头。由于接头和酶切位点的DNA序列已知，因而可以设计标准的PCR通用引物。在该通用引物的3′端分别延伸一个或几个碱基，通过引物间的两两组合，将PCR产物分成10个或4n ×（4n ＋1）/2个亚组，从而使基因片断通过选择性引物被有效地分配于不同的亚组中。
3.消减PCR
消减PCR（subtractive PCR）是一种将消减杂交与抑制性PCR两关键技术相结合的PCR方法，原理上等同于抑制消减杂交（suppression subtraction hybridization，SSH）技术，该方法运用了杂交的二级动力学原理，即丰度高的单链cDNA在复性时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来存在丰度差异的单链cDNA相对含量趋于基本一致。而抑制PCR则是利用链内复性优先于链间复性的特点，使非目标序列片断两端的长反向重复序列（long inverted repeats）在复性时产生“锅柄样”（panhandle‐like）结构或类似发夹的互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行高效率的动力学富集，增加了获得低丰度差异表达cDNA的概率。
消减PCR的主要步骤包括：
（1）提取两种不同试验材料（tester 和driver）的差异mRNA并反转录成cDNA，分别作为检测cDNA（tester cDNA）和驱赶cDNA（driver cDNA）。用限制性内切酶将cDNA消化产生平均长度低于500bp 的平头末端cDNA片断。
（2）将待检测cDNA分成均等的两份，分别连上接头1或接头2，接头由一长链（40nt）和一短链（10nt）组成，接头设计为5′端无磷酸化的平端双链DNA片断，保证了其以唯一的方向与cDNA片断连接：长链3′端与cDNA5′端相连。长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。此外，接头上还加入了T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后的克隆和测序提供方便。
（3）接下来进行两轮消减杂交。第一次杂交：将上述两份待检测cDNA分别与过量的驱赶cDNA混合，变性后复性，进行一种不充分的消减杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在，杂交的结果实现检测单链cDNA的均等化（normalization），也即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致。
由于检测cDNA中与驱赶cDNA序列相似的片断大多与驱赶cDNA形成异源双链分子，使检测cDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。第二次杂交：合并第一次杂交后的两份杂交产物，同时加入新的变性驱动cDNA进行复性杂交。此时只有第一次杂交后经丰度均等化和消减的单链检测cDNA和驱动cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子，它的两个5′端分别连上了来自两个样本的不同的接头。杂交完成后补平末端。
（4）用设计的两对巢式引物取上述产物进行PCR扩增。第一次用外侧引物作PCR扩增，这时只有两端是不同接头的双链cDNA分子才能呈指数扩增。而两端连上相同接头的同一片断由于末端有长反向重复序列，由于所加引物短于接头以及链内退火优于链间退火，在复性过程中形成“锅柄样”结构，无法作为模板与引物配对而不能得以扩增，最终的结果是差异表达cDNA序列得到大量的扩增。第二次选用内侧引物作PCR扩增，基于PCR抑制效应的存在，使差异片断获得大量富集并提高了产物的特异性。
（5）对获得的差异片断做进一步分子杂交鉴定和序列测定、分析及功能鉴定等工作。相比其他有关相似技术，消减PCR用于扩增获得差异表达的未知序列基因最大的优势，一是特异性强、假阳性率低，二是敏感性高，适于低丰度表达基因，三是速度快，效率高。但此法最大的不足是需要较多的起始材料。目前此技术已用于很多新基因的克隆。
