5.3.6聚合酶链反应技术应用
在PCR技术发明之前，有关核酸研究所涉及的许多制备及分析过程，都是既费力又费时的工作。例如，为了将一种突变基因与已经作了详细研究鉴定的野生型基因进行比较，首先就必须构建突变体的基因组文库，然后应用有关探针进行杂交筛选等一系列繁琐的步骤，才有可能分离到所需的克隆。只有在这种情况下，才能够对突变基因作核苷酸序列的结构测定并同野生型进行比较分析。然而应用PCR技术则能够在体外快速地分离到突变基因，其主要步骤是根据预先测定的野生型基因的核苷酸序列资料，设计并合成出一对适用的寡核苷酸引物，用来从基因组DNA中直接扩增出大量的突变基因DNA产物，以供核苷酸序列测定使用。另一方面也可以根据需要在引物的5′端加上一段特殊的额外序列。按设计要求，在第一次杂交时，引物中的这段额外序列因无互补性是不能参与杂交作用的，而只是其3′端的部分序列退火到了模板DNA的相应部位，在随后的反应过程中，此5′端的额外序列才掺入到了扩增的DNA片段上。由于这种加在引物5′端的额外序列可以根据实验者的特定需求而精心设计，因此在实际的研究工作中具有很大的应用价值，提供了很多的灵活性。因此，它是基因克隆的一种有效方法。另外，还有反向PCR、不对称PCR等等。
PCR技术问世以来，以其简便、快速、灵敏、特异性好等优点受到分子生物学界的普遍重视，被广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于cDNA文库的构建，突变体的分析，重组体的构建，基因表达调控的研究，SSR、RAPD、AFLP、RFLP 等基因多态性的分析，染色体步移与基因的定位，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定包括亲子鉴定等诸多方面，近年发展的定量PCR技术还可用于基因的表达水平分析或基因在生物体内的拷贝数分析。
5.4荧光定量PCR技术
PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过对光密度扫描来进行半定量分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量，例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
自1993问世，特别是1996年美国ABI 公司生产出世界上第一台全自动实时荧光PCR仪以来，因其高特异性、高灵敏度、所需时间短、并且还能进行核酸定量而备受欢迎，它不但解决了传统PCR方法易污染，需要做阳性确认等缺点，并且由于实时荧光PCR技术有定量检测功能，扩大了传统PCR方法的应用领域，使得疾病治疗效果、转基因产品定量检测等一些技术难题很容易得到解决，迅速在各有关领域得到了广泛应用。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。
5.4.1荧光PCR的特点
1.实现实时监测，消除交叉污染
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，实现对整个PCR进程的实时监测。
此外，实时荧光PCR采用闭管分析，无须电泳等PCR后处理步骤，有效消除核酸的交叉污染。
2.特异性强
由于在PCR反应体系中加入荧光探针，使得非特异性产物不能与探针杂交，尤其对与特异性产物相对分子质量接近、通过电泳无法分开的产物更为有效，而且分子信标、杂交探针和新型的Taq Man MGB（Mino，Groove Binder）探针可检测出靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变。
3.定量结果准确
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。而实时荧光PCR方法通过采用外标准曲线定量的方法，其正确性已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
5.4.2实时荧光定量PCR技术原理
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（threshold value）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
5.4.3荧光探针和荧光染料
实时荧光PCR技术的关键是使用了荧光探针及其相应的荧光信号检测装置。所用荧光探针种类很多，实现的途径也不完全相同，但基本原理都是根据荧光共振能量转移现象（fluorescence resonance energy transfer，FRET）设计的。当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象就是FRET。FRET 现象发生程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10Bill 时即可发生FRET ；随着距离的延长，FRET 呈显着减弱。FRET 现象已广泛应用于核酸分子检测、生物大分子内和分子间相互作用等生物学研究。
