目前荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：内嵌染料（SYBRGreen Ⅰ）、双标记探针、FRET探针、分子信标和Ampliflor。其中SYBR Green Ⅰ染料法不需要设计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便的实时监测方法，常常被用于进行RNA表达相对定量以及DNA定量研究中。TaqMan 荧光探针使用最为广泛，另外还有一种非特异的荧光染料双键DNA定量检测方法。下面分别进行简要介绍：
1.SYBR GreenⅠ
SYBR Green Ⅰ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green Ⅰ的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR Green Ⅰ在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过分析熔点曲线可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。但是，由于SYBR Green Ⅰ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。
2.分子信标
分子信标（molecular beacon）是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于黑色淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。
分子信标的茎环结构中，环一般为15～30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎部一般为5～7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标的设计必须非常仔细，要求在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
3.TaqMan 探针
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5′端，而淬灭基因则连接在3′端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭基因接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5′外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基因分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。TaqMan 探针工作原理。
4.LUX 引物
LUX （light upon extention）引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的一对引物中的一个引物3′端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。与TaqMan 探针和分子信标相比，LUX引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为LUX引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。
实时荧光定量PCR的过程大致是：①设计并合成实时PCR引物。引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR Green）的PCR优化。②样品RNA抽提。RNA质量检测紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
③使用逆转录酶进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。④制备标准曲线样品。进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于制作标准曲线。⑤标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG 的实时PCR反应液中，进行实时PCR扩增和检测。⑥对照标准曲线分析检测结果，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。最后提供实验报告，包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对用不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外，我们可以不定期地对PCR产物或样品进行定性分析，例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP 检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域，其中最主要的应用集中在比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等）及特定基因在不同相的表达差异，比较正常组织与病理组织中各种mRNA表达量的差异，验证基因芯片实验结果，验证RNA干扰实验结果等几个方面。
本章小结
PCR是重要的分子生物学常用技术，本章详细介绍了PCR的原理和反应体系的构建，包括PCR所需要的各种基本成分（含模板、引物、反应缓冲液、dNTP 和耐热聚合酶等）、反应操作过程（即通常的变性、退火、延伸三步）以及实现PCR扩增的反应操作条件，并对PCR所用的引物设计原则做了详尽的阐述。PCR是一种实用性非常强的技术，尤其在有关目的基因的克隆或相关DNA序列的分离上。因此，本章重点介绍了目前常用的用于分离DNA序列或基因的各种PCR技术，不仅有用于扩增已知序列的技术的介绍，还有用于分离已知序列侧翼的未知DNA序列的各种技术，对未知序列的分离技术也作了比较全面的介绍。
最后对PCR技术的应用作了简单描述。实时荧光PCR因其高特异性、高灵敏度，并且还能进行核酸定量而备受欢迎，它不但解决了传统PCR方法易污染、需要做阳性确认等缺点，并且由于实时荧光PCR技术有定量检测功能，扩大了传统PCR方法的应用领域，尤其在疾病治疗、转基因产品定量检测等一些技术难题方面显得很优越，从而迅速得到各有关领域的广泛应用。通过本章内容的学习，希望在掌握有关技术与理论的基础上，能学以致用，把PCR的有关技术灵活应用于科研、生产当中。
思考题
1.什么是反向PCR？
2.已知部分序列，如何进行全长序列的克隆？
3.荧光实时定量PCR所使用的荧光化学方法有哪些？ 基本原理是什么？
4.假设通过农杆菌介导的转基因技术，借助转基因过程的T‐DNA转移与整合进水稻基因组，把一个通过基因重组技术已插入T‐DNA内的抗旱特异基因（水稻本身无此基因）也连带整合进水稻基因组，获得一株抗旱能力明显增强的转基因水稻，但此转基因水稻出现了株高比非转基因对照变矮的非靶性状。请用有关PCR技术分析解答下列问题：①如何确认此苗是转基因苗？ ②目的基因是否表达？ 表达量如何？ ③分析株高变矮的可能原因。
（陈忠正、邹克琴）
