因为lac启动子具有上述可控性，所以最早期研究中常用来构建表达载体，构建时，将Plac 连同其下游编码β半乳糖苷酶的Z 基因一起构建到载体上，并且在Z 基因中设立多克隆位点，供目的基因插入。Placuv5是以Plac为启动子的改造形式，其起始效率比原型高，培养基中加入X‐gal显色剂及IPTG诱导物，未插入目的基因时，IPTG诱导物诱导阻遏蛋白失活，结构基因Z基因表达，产生β半乳糖苷酶，与培养基中的X‐gal显色剂反应呈现蓝色菌落；当插入了目的基因破坏了Z基因的结构时，可使重组克隆表现为无色菌落，利用这种特点，容易进行重组子的筛选。
8.2.2trp启动子和tac启动子的表达载体色氨酸操纵子（tryptophane operon），又称trp操纵子，负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，所以它不受葡萄糖或CAP‐cAMP的调控。
色氨酸的合成分5步完成，每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，它们分别编码邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油3磷酶合成酶。trpE 基因是第一个被翻译的基因。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min 处，而前者则位于90min 处。在65min处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），也参与trp操纵子的调控作用。
trp操纵子的另一个调控方式是衰减（attenuation）机制，如图85所示，衰减子位于结构基因E 和操纵基因（O）之间的L 基因中。大肠杆菌在无色氨酸的环境下，L基因和结构基因能转录产生具有6700个核苷酸的全长多顺反子mRNA，当细胞内色氨酸增多时，结构基因转录受到抑制，但L 基因转录的前导mRNA（140个核苷酸）并没有减少，这部分转录物称为衰减子转录物。衰减子转录物中具有4段特殊的序列，片段1和2、2和3、3和4能配对形成发夹结构，而形成发夹结构能力的强弱依次为片段1/2＞ 片段2/3＞ 片段3/4。片段3和4所形成的发夹结构之后紧接着寡尿嘧啶，出现不依赖于ρ 因子的转录终止信号。
这4个片段形成何种发夹结构，是由L 基因转录物的翻译过程所控制的。L 基因的部分转录产物（含片段1）编码14个氨基酸，其中含有两个相邻的色氨酸密码子。这两个相邻的色氨酸密码子在原核生物中转录与翻译的偶联是产生衰减作用的基础。L 基因转录不久核糖体就与mRNA结合，并翻译L 短肽序列。细胞内有色氨酸时，形成色氨酸tRNA，核糖体翻译可通过片段1，并通过片段2。因遇到翻译终止密码，核糖体在到达片段3之前便从mRNA上脱落。在这种情况下，片段1/2和片段2/3之间都不能形成发夹结构，而只有片段3/4形成发夹结构，即形成转录终止信号，从而导致RNA聚合酶作用停止。如果细胞内没有色氨酸，色氨酰tRNA缺乏，核糖体就停止在两个相邻的色氨酸密码的位置上，片段1和2之间不能形成发夹结构，片段2和3之间可形成发夹结构，则片段3/4就不能形成转录终止信号，后面的基因得以转录。
色氨酸操纵子中的操纵基因和衰减子可发起双重负调节作用。衰减子可能比操纵基因更灵敏，只要色氨酸一增多，即使不足以诱导阻遏蛋白结合操纵基因，也足可以使大量的mRNA提前终止。反之，当色氨酸减少时，即使失去了诱导阻遏蛋白的阻遏作用，但只要还可以维持前导肽的合成，仍继续阻止转录。这样可以保证尽可能充分地消耗色氨酸，使其合成维持在满足需要的水平，防止色氨酸堆积和过多地消耗能量。同时，这种机制也使细菌能够优先将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。
利用trp启动子构建的表达载体如ptrED51，是将大肠杆菌染色体DNA的利用Hind Ⅲ酶切产生的含有Trp 操纵子片段连接到pBR322质粒的H ind Ⅲ位点，然后用H ind Ⅲ做部分酶切消化，接着用核酸外切酶Ⅲ和S1核酸酶处理，便可将靠近EcoR Ⅰ单切点的H ind Ⅲ位点消除，获得只有单一Hind Ⅲ识别位点的ptrED51表达载体。
tac 启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc 启动子是trp启动子和lac 启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI 阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI 阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac 操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI 阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc 表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc 载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI 阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG 广泛用于诱导表达系统，但是IPTG 有一定毒性，有人认为制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG 作为诱导物的研究。其中Tac 1是由Trp 启动子的－35区加上一个合成的46bp DNA片段（包括Pribnow盒）和Lac 操纵基因构成，Tac 12是由Trp 启动子的－35区和Lac 启动子的－10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac 启动子受IPTG 的诱导。
8.2.3PL 启动子表达载体
野生型的λ噬菌体中PL 和PR 启动子的转录决定着λ噬菌体进入裂解循环或溶原循环，在正常的感染周期，PL 启动子控制着从基因N 到int 的λ噬菌体左边的DNA的早期转录，是一种活性比trp启动子高11倍左右的强启动子，这个启动子受cI 基因编码的阻遏蛋白的正调控。cI 基因存在着一个温度敏感突变体cIts857，存在温度敏感突变等位基因cI857，它所编码的基因或是存在于大肠杆菌染色体上，或是存在于相容性的质粒分子上，它所产生的阻遏蛋白在42℃时会被失活。所以当大肠杆菌宿主细胞在42℃下生长时，它编码产生的阻遏蛋白质被破坏而失去活性，PL 启动子便启动转录合成出大量的mRNA分子；而在28～30℃下培养时，cI 基因则合成出有活性的阻遏蛋白质，使PL 启动子进入完全抑制的状态。由于具有这样一种特性，我们只要简单地改变培养的温度，就可以诱导或关闭PL 启动子的活性。这就是PL启动子的一个突出优点，而且与lac启动子相比，由单拷贝的λcI 基因所产生的λ阻遏蛋白质，就足以使多拷贝的PL 表达载体的转录处于阻遏状态，如pPLa2311表达载体，pPLa2311质粒是PLa载体系列中一个有代表性的表达载体，它带有一个λPL 启动子，可以控制具有转译起始区的外源插入基因的表达。由于pPLa2311质粒所携带的这种λPL启动子可以接受热敏感的λ阻遏蛋白质的抑制，故在低温下，λPL 启动子的表达活性被完全关闭；而在42℃高温下这种阻遏物失去活性，λPL启动子的表达活性又恢复。所以这种质粒载体可以与带有热敏感的λ阻遏基因cI875的大肠杆菌菌株（如M5219或K12ΔHI）配合使用，也可以与带有编码有cI875基因的相容性质粒pcI875的大肠杆菌菌株配合使用。也就是说，用这些菌株作为pPLa2311质粒的宿主，可以建立起良好的质粒表达体系。
pPLa2311质粒的分子长度为3.8kb，由如下4种片段组成：①来自pBR332的H ae ⅡEcoR Ⅰ片段，该片段的分子长度为1.6kb，编码有氨苄青霉素抗性基因ampr ；②λ噬菌体的H ae ⅢH ae Ⅱ片段，它的分子长度为0.36kb，具有λ噬菌体左边启动子λPL ；③pMK20质粒的H ae Ⅱ片段长度为1.5kb，编码有卡那霉素抗性基因（kanr)；④具有ColE1复制起点的H ae Ⅱ小片段，长度仅有0.4kb，是经pMK20质粒转移而来的。
pPLa2311质粒，对于常用的限制酶，例如H ind Ⅲ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和X ho Ⅰ、EcoR Ⅰ等，都只有一个识别位点。而且，当外源基因克隆到H ind Ⅲ、Sma Ⅰ和X ho Ⅰ三个位点上时，会导致kanr 基因的失活，而克隆到Pst Ⅰ位点上时，又会造成ampr 基因的失活，所以在基因克隆中是一种有用的表达载体。
属于PLa 质粒系列的表达载体，常见的还有pPLa8、pPLa83、pPLa831、pPLa832等，这些质粒基本上都有与pPLa2311质粒类似的性质，但又各自带有一些独特的特性。例如，pPLa8质粒与pPLa2311的差别，只有在于它的ampr 基因上由BamH Ⅰ位点取代了Pst Ⅰ位点。
但尽管如此，却使pPLa8质粒失去了对氨苄青霉素的抗性。将一条具有BamH Ⅰ‐EcoR Ⅰ‐lac 操纵单元EcoR Ⅰ‐BamH Ⅰ编码构造的DNA片段，插入到pPLa8ampr基因BamH Ⅰ位点上，而后再做一些其他的改造，便构成了一种新的质粒pPLa83。它同样也是由λPL 启动子控制表达的，不过除此之外，还带有一个lac操纵单元编码区段，所以由这种质粒转化的大肠杆菌细胞，在Xgal 平板上会形成蓝色菌落，因而易于检测。
为了能够在大肠杆菌宿主细胞中最有效地高水平表达克隆的真核基因，人们已经利用λ噬菌体的调节型强启动子（regulatable strong promoter）构建了许多质粒载体，除了上述pPLa2311质粒之外，pPLc2833也是有效的表达系统之一。pPLc2833质粒载体的主要结构包括三个部分：①一个调节型的强启动子PL；②一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因ampr ；③一个直接位于PL 启动子下游的多克隆位点（MCS）区。
若用pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA复制起点，由此形成的新质粒pCP3如图89所示，在大肠杆菌宿主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性，便得到明显的提高。而且这个质粒还是一种温度敏感型的载体，当培养温度上升到42℃时，其拷贝数就会比平常增加5～10倍。PCP3质粒，具有来自pPLc2833质粒的一个PL 启动子和一个氨苄青霉素抗性基因，以及一个来自pKN402质粒的DNA复制起点。
被pCP3质粒转化的大肠杆菌宿主细胞，放置在较低的温度（28℃）下培养时，整合在染色体DNA中的cI 基因是有功能的，在其表达的阻遏物的作用下，PL 启动子的活性被关闭，同时pCP3质粒亦具有正常的拷贝数，即每个细胞平均拥有60个左右；而当大肠杆菌宿主细胞被转移到较高温度（42℃）下培养时，cI 阻遏物失去活性，于是PL 启动子的功能便被启动，而且质粒的拷贝数也明显上升，平均每个细胞达713个左右。
PCP3质粒所具有的这些特性，特别是对培养温度的敏感性，使之成为一种十分有效的表达载体。把T4DNA连接酶基因克隆在pCP3质粒的多克隆位点上，并将其宿主细胞放置在42℃下培养，由此制备的大肠杆菌细胞总蛋白质中，T4DNA连接酶占20%左右，达到了相当高的表达水平。
8.2.4T7噬菌体RNA聚合酶/启动子表达载体系统
尽管大肠杆菌表达载体的种类繁多，但基于T7噬菌体RNA聚合酶（T7RNAP）及其启动子之间识别的表达系统，因其高特异性、高效性及可控制性，而成为在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大的表达系统之一。一些公司（如Novagen 公司）出品的pET 系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
