pET 系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体。pET 系列载体的构建的原理如下：T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，并对大肠杆菌任何基因的启动子没有激活作用。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右，可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平，在适宜的条件下，T7噬菌体RNA聚合酶/启动子表达系统表达的基因产物可占细胞总蛋白的25%以上。另外，T7噬菌体RNA聚合酶对大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素（如利福平）有抗性，可用以某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列，高水平地表达在其他表达系统中不能有效表达的基因。因此，对于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子表达载体系统中除了有T7噬菌体启动子还需有合成T7RNA聚合酶的基因，并处于可控制状态。
大肠杆菌BL21（DE3）是常用的pET 表达载体的宿主菌，该菌对T7噬菌体RNA聚合酶和目的基因的转录实行多层次的调控。
在该菌株BL21区整合有一个λ噬菌体的DNA，在λ噬菌体的DE3区有一个T7RNA聚合酶的基因（T7基因1），该基因受lacUV5启动子控制。当pET载体进入BL21（DE3）细胞后，由于宿主细胞的lacI基因表达产物的抑制，lacUV5启动子不能开始转录，便不能产生T7RNA聚合酶，载体上的目的基因由于缺乏T7RNA聚合酶的识别启动而无法转录。当存在IPTG诱导物后，lacUV5启动子被抑制作用解除，T7RNA聚合酶基因表达产生T7RNA聚合酶，从而启动T7启动子控制的外源基因的表达。
表达载体pET 5α是典型的T7噬菌体启动子表达载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。
8.3外源蛋白质表达部位
大肠杆菌细胞被内膜（又称质膜）和外膜分隔成胞内、周质和胞外三个腔室，相应地在E.coli中表达的异源重组蛋白可定位于胞内、周质空间或胞外培养基中。外源目的基因在原核细胞中的表达形式包括包涵体、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白等5种，有些在细胞质中表达，有些在细胞周质中表达，还有的则分泌到细胞外，然而表达部位不同，对制备克隆基因的表达产物有很大的影响，各种表达形式各有利弊，目前关于如何获得有生物活性的蛋白是科研工作者研究的重点。
8.3.1细胞质表达
1.包涵体概念及性质
细胞质中表达的外源蛋白多以包涵体的形式存在。所谓包涵体（inclusion bodies，IB），是指存在于细胞质中的一种不可溶性的蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物，除了主要含有重组蛋白外，还有RNA聚合酶、核糖核蛋白体和外膜蛋白、DNA、质粒DNA、RNA、脂多糖等，具有很高的密度。包涵体具有正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，因而没有生物活性。包涵体具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂（如尿素、盐酸胍等）。包涵体在相差显微镜下观察为黑色的斑点，也称为折射体（refractile body）或光遮射体。
以包涵体形式表达的外源蛋白有其优缺点，其优点表现在：①简化了外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内的分离纯化程序，因为包涵体的水难溶性及其密度远大于其他细胞碎片结合蛋白，通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来；②以包涵体形式存在于细胞中，外源蛋白在宿主细胞中往往面临着被宿主细胞的蛋白酶降解的威胁，形成包涵体速度较快时，就可以避免降解；③蛋白质的产量高，二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达；④蛋白质没有活性，因此不会使宿主细胞受伤害。
其缺点主要体现在包涵体的分离及生物活性的恢复方面，在离心洗涤分离包涵体的过程中，难免会有包涵体的部分流失，导致收率下降，并且包涵体的溶解需要使用高浓度的变性剂，在无活性异源蛋白的复性之前，必须通过透析超滤或稀释的方法大幅度降低变性剂的浓度，这就增加了操作难度，一些相对分子质量大的蛋白质经过变性复性基本是不能正确地进行折叠，很难获得有活性的目的产物。
2.包涵体的形成原因
在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因而形成包涵体，其形成主要原因是：
（1）基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体，其原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确地配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
（2）重组蛋白的氨基酸组成：一般来说，含硫氨基酸和脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关，另外，亲水性氨基酸和氨基酸总数也对形成包涵体有重要作用，电荷的平均数、形成转角的氨基酸组分是形成包涵体的关键原因。
（3）重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
（4）重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。所谓分子伴侣（molecular chaperone），是专指一类能够阻止诸如聚合作用并帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确组装或折叠，而其本身并不是最终形成的功能蛋白质的组成部分。近几年的研究发现，分子伴侣在生物大分子的折叠（folding）、组装（assembly）、转运及降解等过程中都起着协助作用，也参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立，细胞周期调控、抗衰老、凋亡调控等过程，其中最大一类分子伴侣是热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）。
（5）蛋白质在合成之后，在中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，而有的表达产率很高，如Aspartase 和Cyanase，表达产率达菌体蛋白的30%，也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
3.包涵体的分离及复性
包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤。
菌体破碎大多采用高压匀浆、高速珠磨或低温反复冻融、超声破碎等物理方法或酶裂解法。单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未被破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难；在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显着提高包涵体的纯度和回收率。用化学方法使细菌裂解，然后以5000～20000g 15min 离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。依据表达目标产物的性质选用不同的方法。
洗涤主要是为了除去包涵体上黏附的杂质，如膜蛋白或核酸。应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂，过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2mol/L 尿素在50mmol/L Tris pH7.0～8.5，1mmol/L EDTA 中洗涤。此外，可以用去垢剂TritonX 100、SDS、脱氧胆酸盐等洗涤去除膜碎片和膜蛋白，其中Triton X 100可以较高的回收率获得包涵体重组蛋白，但去除杂蛋白的效果不完全；脱氧胆酸盐的清洗的纯度较高，但会使重组异源蛋白部分溶解并损失，导致回收率下降。由于去垢剂的效果与包涵体中重组异源蛋白的性质具有一定关系，因此包涵体清洗条件的优化显得尤为重要。
在包涵体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的，它们之间的聚集靠非共价键维持，包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等，唯一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包涵体，使蛋白变性，变性即破坏非共价键，并用还原剂打开二硫键。溶解过程一般用强的变性剂，如尿素（6～8mol/L）、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。
一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl 等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50～100mmol/L 2BME 或DTT，也可使用5mmol/L 浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键的某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。因此，选择溶解方法时要根据目标产物的组成。
分离溶解包涵体后最重要的任务是使蛋白质复性，包涵体蛋白的复性被认为是一种复杂的工作。由于每一种蛋白都有其特殊性，因而重组蛋白的复性方案一直是决定基因工程产品产业化是否成功的关键因素之一。除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，可以获得天然的活性蛋白。
应用最普遍的再折叠方法有透析、稀释、超滤等。透析法通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，如用8mol/L 的尿素溶液作为起始透析液，然后逐渐稀释透析液的尿素浓度，由于变性剂浓度连续下降，不会出现变性剂浓度突变的情况，可能有助于减少某些蛋白质复性中产生的沉淀，提高活性蛋白收率。稀释是最简单、也较有效的复性方法，经稀释，变性剂及还原剂浓度下降至一定时，蛋白质分子开始重新折叠。稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释。超滤复性是选择合适截留相对分子质量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质不通过，伴随变性剂除去以相同的速度加入复性液。
高蛋白质浓度下的复性通常有三种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性；三是复性在中等变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确的复性。
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法，如IL11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL 2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子（0.05%SDS，7.5～30μmol/L CuCl2）的方法，25～37℃下反应3h，在EDTA 浓度至1mmol/L 时终止反应，复性后的二聚体低于1%。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
