影响复性效率的因素主要有：
（1）蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用。蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而一般浓度控制在0.1～1mg/ml ；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新聚集的缘故。所以采用再水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。
（2）pH和温度：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0～9.0。
（3）此外，影响复性效率的因素还有变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
如何提高包涵体蛋白的复性产率？ 目前方法主要有：
（1）氧化还原转换系统：对于含有二硫键的蛋白质，复性过程应能够促使二硫键形成。
常用的方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT 再氧化法。最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG，而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等也可应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1～3mmol/L 还原型巯基试剂，还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10：1～5：1。
（2）添加低分子化合物。低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。
如盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2＋或Cu2＋可以稳定蛋白质的折叠中间体，从而防止蛋白质的聚集，加入Tris 浓度大于0.4mol/L 的缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。L‐Arg 浓度为0.4～0.6mol/L 有助于增加复性中间产物的溶解度，已成功地应用于很多蛋白（如t‐PA）的复性中，可以抑制二聚体的形成。NDSBs 是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族，NDSBs 由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水集团组成，故不属于去垢剂，不会形成微束，易于透析去除，目前常用的有NDSB 195、NDSB201、NDSB 256。
（3）PEG‐NaSO4两相法。用PEG（聚乙二醇）和NaSO4作为成相剂，然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复性，但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。
（4）分子伴侣和折叠酶法。这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin 等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。
（5）另外，提高复性率的策略还有许多，如非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂CHAPs、Triton X 100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl 等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质复性的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。
8.3.2细胞外周质表达
与在细胞质中表达的蛋白相比，在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。外周质蛋白占总细胞蛋白的4%，较有利于目的蛋白的浓缩和纯化。其次，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N 末端。此外，外周质中的蛋白质降解作用也较少发生。
蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽。表达的目的蛋白多数不含有信号肽，需要构建特殊的载体，在目的基因前加上一段信号肽，许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于E.coli 中外源蛋白质从内膜到外周质的转运，如E.coli 的PhoA 信号、OmpA、Omp T、L amB 和Omp F 以及金黄色葡萄球菌A 蛋白、鼠RNase 和人生长激素信号肽等。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证蛋白质有效地通过内膜转运。改善蛋白质转运到外周质的策略包括提供蛋白质转运和加工所需的成分：过量表达信号肽酶Ⅰ，利用p rlF 突变株，共表达参与膜转运的几种蛋白质，降低蛋白质的表达水平以防止转运工具的过载。
8.3.3细胞外分泌
将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略，因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli 在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli 的分泌途径。
Pugsley 对革兰阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli 中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：①利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；②利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染，最突出的例子是溶血素基因，该基因曾被用于构建分泌的杂交蛋白；第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。
在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，蛋白的外泌表达发生于细胞生长后期。但所用的启动子为A蛋白自身的启动子，该启动子在大肠杆菌中为非可控性的组成性表达，且强度较弱。如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。目前研究者正在进行这方面的尝试，且已经取得初步成效。如分泌型表达载体pEZZ18的表达元件有lac启动子、蛋白质A的信号肽序列和两个合成的Z 功能域（domain）。
来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的蛋白质A具有与抗体IgG结合的能力，Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B功能域而设计的。融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，分泌到培养基中。然后用固定了IgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个相对分子质量为14000的“ZZ”肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。这种表达方式可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋白活性的目的。
此类载体的主要元件除启动子和SD序列外，在SD下游，选用有效的信号肽序列编码信号肽，对引导蛋白跨膜到细胞周质中或细胞外非常关键。
8.3.4融合蛋白
1.融合基因和融合蛋白
融合基因（fusion gene）通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型：①由报告基因的编码序列区和另一个基因的启动子及其调节序列构成的；②由一种异源蛋白质基因的编码序列区同宿主细胞的诱导型启动子构成。
所谓融合蛋白（fusion protein），是指由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转译产生的单一的多肽序列。它们的功能往往是异常的，或者是已经发生了变化。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列（fusion tag）的3′末端，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N 末端含有由高表达蛋白序列编码的片段。表达蛋白序列所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的一部分，比如6x His Tag、β半乳糖苷酶融合蛋白和trpE 融合蛋白、谷胱甘肽S 转移酶（GST）融合蛋白以及硫氧还蛋白（Trx）融合蛋白等。
由于利用所引入的高表达蛋白序列的特性通常可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，更多情况下选择融合表达是为了简化重组蛋白的纯化，因此出现两种融合表达类型：一是高表达蛋白序列位于目的蛋白的N 端，这时高表达蛋白序列可以提供良好表达所必需的信号，帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量（C 端）不完整的表达产物会一起被纯化。另一是高表达蛋白序列位于目的蛋白的C 端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N 端时，fusion tag 位于C 端可能减少对其功能的影响，反之亦然。
进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag 的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusiontag 部分。
早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰（Met↓）、BNPS 3甲基吲哚（Trp↓）、羟胺（Asn ↓Gly）等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性，其中有用的酶有Ⅹ a 因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列（如在凝乳酶中为7个氨基酸），从而降低了蛋白质中其他无关部位发生断裂的可能性。但酶解法存在成本高（这些蛋白酶价格一般都相当昂贵）、反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。
IMPACT 系统的推出是融合表达系统的一个重大突破。该系统最大的优点是表达的融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusion tag的精确切割。IMPACT（intein mediated purification with an affinity chitin‐binding tag）系统利用一个来源于枯草杆菌的5000大小的几丁质结合域（chitin binding domain，用于亲和纯化）和一个来源于酵母intein的蛋白质组成一个双效的fusion tag，再与克隆到多克隆位点的目的基因融合表达。Intein 是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子intro在RNA的剪接中所起的重要作用，intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N 端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白，也就是说，融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4℃）条件下用含DTT 或者巯基乙醇或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将fusion tag留在纯化柱上，而还原剂的小分子可以非常简单地去除。该系统的出现是融合表达系统的重大突破，完全避免了蛋白酶的使用，不但可以有效降低成本，提高效率，也避免了蛋白酶与目的蛋白的分离纯化的麻烦。
随后改进的IMPACT‐CN系统提供了两种选择，即fusion tag可以选择在目的蛋白的C端或者N 端，使克隆或表达都能满足不同需要。但是这一系统仍然有一个缺陷，那就是含有较多二硫键的蛋白不适用这一系统，因为还原剂的存在会破坏/影响蛋白的二级结构。
IMPACT‐TWIN 系统在多克隆位点的两端各有一段intein和几丁质结合域的fusiontag，提供了三种选择：①在克隆时切掉N 端的fusion tag1，插入目的基因，同原来的系统一样，可以在表达产物挂上亲和纯化柱后加入还原剂，将目的蛋白从fusion tag上解离并洗脱下来，得到的目的蛋白C端带有硫酯键，可以直接用于连接一个标记物、非编码氨基酸或者另一个蛋白；②在克隆时切掉C端的fusion tag2并插入目的基因，当表达产物挂上亲和纯化柱时只需改变pH值和温度（pH7，25度）即可将目的蛋白从fusion tag 上解离并洗脱下来。这不但避免了蛋白酶的使用，更重要的是也避免了还原剂对含丰富二硫键的蛋白二级结构的破坏。
由于调节缓冲液的pH值非常方便且无需另外去除洗脱产物中的还原剂，这大大简化了目的蛋白的纯化过程，也扩大了该系统的应用范围。③可以将目的基因插入两个fusion tag 之间，这样表达产物的两端都含有fusion tag，当产物挂上亲和纯化柱并经过两级洗脱后，由于目的蛋白两端分别有一个硫酯键和半胱氨酸，可以自身环化得到环形蛋白。
