2.表达GST 融合蛋白的表达载体
GST 表达载体在启动子tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（thrombin）切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli 易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其他细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其他还有Ⅹa因子（factor Ⅹa）和肠激酶。
谷胱甘肽转移酶又称为配偶体，是指融合蛋白中与目标蛋白质连接的别种蛋白质组分。
常见的配偶体除了谷胱甘肽转移酶外还包括葡萄球菌蛋白质A（SPA）、链球菌蛋白质G（SPG）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、硫氧还蛋白等。配偶体的存在为融合蛋白质提供了许多便利，诸如阻止包涵体的形成，改善了蛋白质的折叠性能，限制了蛋白质的酶解活性。应用附加的亲和标记物，如FLAG、His6、c-Myc 多肽等可简化一般性的蛋白质的检测与纯化程序。
8.4提高外源基因表达效率的方法
研究者在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质，若基因的表达量仅仅停留在实验室检测水平是不够的，要满足商品生产的需要，大量地获得目的蛋白，须高效率地表达外源基因。影响外源基因的表达的因素有很多，如启动子强度、DNA转录起始区的序列、密码子的选择等。提高外源基因的表达从以下几个方面考虑，mRNA分子的二级结构、5′UTR 的序列、转录的终止、质粒的拷贝数、宿主细胞的特性、目的蛋白的稳定性及其对宿主细胞的影响等等。这些因素都会影响外源基因在宿主细胞中的表达量。提高外源基因的表达效率可以从以下几个方面着手。
8.4.1外源基因的有效转录与外源基因高效表达
1.外源基因
外源基因不能带有内含子序列，因为原核细胞没有能够对pre‐mRNA进行剪接修饰的系统，所以获得目的基因的mRNA后反转录成cDNA后进行操作。考虑大肠杆菌宿主细胞的密码子偏好问题，大肠杆菌基因对密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码子中往往只有一个或两个被频繁地使用，其他不常使用的被称为稀有密码子，稀有密码子的tRNA在细胞中的丰度很低，外源基因的mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的tRNA供不应求，影响翻译的效率，因此，对目的基因可以通过点突变的方法，将外源基因中的稀有密码子转换为在大肠杆菌细胞中高频出现的同义密码子。
2.提高质粒拷贝数及稳定性
基因的拷贝数越大，表达的强度必定越高，除了上述方法外，提高基因剂量的有效方法，将基因克隆到高拷贝数的质粒上。质粒分离还存在着分离的不稳定性，如果细菌由于产生出某种突变而失去了重组质粒，或者经过结构的重排使重组基因无法表达，或者质粒的拷贝数大大降低，那么突变的菌株即有较高的生长速度，迅速生长的菌株称为培养物中的优势菌株。由于缺陷型分配可造成质粒分离的不稳定性。
3.高效表达载体
构建高效率的表达载体，着重于转录起始的启动效率及翻译的起始效率两方面。①引入强启动子，启动子的效率与－10区、－35区及两个区域之间的距离有关，一般来说－10区、－35区碱基组成越接近保守序列，及两者之间的距离越接近17bp，启动效率越强，但具体实验还须根据不同的启动子通过点突变的方法来确定最佳的启动子效率；②调整SD序列，使SD序列完全与16S rRNA的反SD序列互补配对，并且根据外源基因的表达不同情况，调整SD序列与起始密码子ATG 之间的距离及碱基的种类，设法防止转录后的mRNA的5′UTR 区形成二级结构。
在原核生物中，最理想的强启动子应该是：在发酵的早期阶段，表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免表达载体不稳定、细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题；当细胞数目达到一定的密度，通过各种诱导（如温度、诱导物等）使阻遏物失活，RNA聚合酶快速启动转录。Lac、Trp、λPL、λPR、Tac、PhoA 等都属于原核细胞的可调控强启动子。T7噬菌体启动子则是另一种类型的启动子，由于其只为T7噬菌体RNA聚合酶所识别，被T7噬菌体RNA聚合酶所起始的转录是非常活跃的，在1～3h 之内目标基因的RNA转录物可达rRNA水平，而宿主细胞RNA聚合酶不能识别它起始转录。由于T7噬菌体RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子控制下的所有的DNA序列，所以近年来很多实验室开始选用T7噬菌体启动子对外源基因进行高水平表达。所以无论是可诱导的（inducible）还是组成型的（constitutive）启动子，在适当的条件下都可以使外源基因高水平表达。
4.增强子
另外，构建载体时可增加翻译增强子序列，已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在E.coli中显着增强异源基因表达的序列。从T7噬菌体基因10前导序列g10L 中鉴定了－9bp 的序列，该序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10L 能使多种基因的表达水平提高几十到几百倍。若将其置于合成SD序列的上游，按照β半乳糖苷酶的活性与Lac‐ZmRNA的水平来估计，g10L 序列能使LacZ 的翻译水平提高上百倍。另外有人研究表明，在mRNA的5′非翻译区（UTR）鉴定了一个U 富含序列，该序列同样具有翻译增强子活性。
在编码RNaseD的rndmRNASD位点的上游，有一个U8序列对该mRNA的有效翻译是必需的。缺失这一区域会显着降低翻译水平，但不影响mRNA的水平和转录起始位点。
8.4.2转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何保证mRNA有效地延伸、终止，这也是影响基因高效表达的重要因素。转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。例如可以通过下列方法：①除去衰减子。衰减子具有简单终止子的特性，在原核细胞中它处于启动子和第一个结构基因之间。由于衰减子是负调控元件，为保证mRNA转录完全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。②插入抗转录终止序列。为了防止mRNA在转录过程中非特异性终止，抗转录终止序列可加入到表达载体上。③强转录终止序列。存在正常的转录终止子也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是保证正确的转录终止，防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。
所以在设计表达载体时要考虑到上述因素。对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly（A）加入位点，是外源基因高水平表达的重要因素。转录终止信号使DNA从反向链进行转录，产生反义mRNA的几率减小到最低限度，从而减少了这种反义mRNA通过分子杂交阻遏基因表达的几率。poly（A）加入的信号序列AAUAAA 对于mRNA3′端的正确加工和poly（A）的加入至关重要，有实验指出，AAUAAA 位点的缺失，使基因的表达减少90%。但无论是转录终止序列、衰减序列还是抗终止序列，都是通过宿主细胞内的反式作用因子来起作用的。从这个意义上讲，基因的高效表达是基因、载体、受体细胞协同完成的。
8.4.3有效的翻译起始与外源基因高效表达
目前公认有效的转录起始和翻译起始是外源基因高效表达最为关键的两个因素。翻译起始是多种成分协同作用的过程，这其中包括mRNA、16S rRNA、fMet tRNA之间的碱基配对，同时还包括它们与核糖体S1蛋白、蛋白合成起始因子之间的相互作用，从而促进蛋白合成的起始。在原核细胞中影响翻译起始的mRNA结构因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列，即原核细胞mRNA5′端非翻译区同16S rRNA3′端的互补的保守序列）、起始密码与SD序列之间的距离和核苷酸组成、mRNA的二级结构、SD序列上游的5′末端翻译序列、蛋白编码区的5′端序列等。
翻译起始可达最大效率的一般条件是：①AUG 是最佳的起始密码子，GUG、UUG、AUU 和AUA 有时也用，但非最佳选择。②SD序列（即核糖体结合位点的序列）一般至少含AGGAGG 序列中的四个碱基。SD序列的存在对原核细胞mRNA翻译起始至关重要。
