③SD序列与起始密码子之间的距离以9±3个核苷酸为适宜。也有报道，如果SD序列同16S rRNA3′端的互补碱基大于8，那么上述两者之间的距离不重要。④除SD序列外，处于起始密码子前的两个核苷酸应该是A 和U（在－3位应为A），即AUA 序列。⑤如果在起始密码子AUG 后的序列是GCAU 或AAAA，能使翻译效率提高。⑥在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。实验表明，通过突变mRNA5′末端翻译区减少或除去某些茎环结构可以提高翻译的起始效率。
对于真核细胞基因，在mRNA的5′末端翻译区不存在SD序列，但对绝大多数有效的mRNA翻译起始而言，一个共有序列5′CCA（G）CCATGG 3′是必需的，而其中最重要的是在－3位应是嘌呤碱基，而在＋4位应是G。通过突变改变起始密码子附近的这一共有序列，可使翻译起始频率下降90%。如果在起始密码子的上游区存在另外一个起始密码子，而特别是又不被一个符合读码框的终止密码子所隔断，那么这个上游起始密码子会降低正常翻译的起始。在表达载体构建中应注意这些问题。
8.4.4终止密码子选择与外源基因高效表达
在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所调控，RF1识别UAA 和UAG，而RF2识别UAA 和UGA。三个终止密码子的翻译终止效率是不同的，其中UAA 在基因高水平表达中终止效率最高。特别是在原核细胞中，由于UAA 为两个释放因子所识别，因此在基因工程中。一般采用UAA 作为终止密码子。在实际操作中，为了保证翻译有效终止，万全之策是用一连串的终止密码子，而不只是一个终止密码子。
8.4.5外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶所降解，这是基因能否高效表达的一个重要因素。蛋白质水解是一个非常有选择性的、严格控制的过程，它影响到蛋白质在细胞中的积累。很多克隆的蛋白质被宿主细胞中的蛋白水解体系视为“非正常”蛋白而加以水解。这种选择性降解意味着，受体细胞中的自身蛋白所具有的确定的构象特性，使其不受蛋白水解酶的降解。如果外源蛋白的构象与天然产物相似，遭到降解的可能性就低。
可采取以下措施避免表达的蛋白被选择性降解：
（1）构建融合基因，产生融合蛋白 融合蛋白的载体部分通过构象改变，使外源蛋白不被选择性降解。这对编码相对分子质量较小的多肽或蛋白的外源基因尤为合适。
（2）构建成可分泌的蛋白 通过基因操作将外源蛋白的N 端带上信号肽，使外源基因表达产物可以分泌到E.coli 细胞的周质或直接分泌到培养基中。应该指出，并不是所有的外源蛋白都可以通过基因操作成为可分泌蛋白。
（3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达 这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。然而，包涵体的形成给如何获得具有天然构象和活性的蛋白质提出挑战。经过包涵体纯化的重组蛋白必须经过变性复性的处理，此过程到目前也没有统一的工艺过程。尽管目前还利用包涵体来高效表达外源基因，但人们正在努力寻求出一种稳定、可溶（或分泌）的高效表达技术。总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元件。
（4）提高外源蛋白的稳定性 大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，某些外源基因的表达产物会被宿主细胞的蛋白水解酶识别而降解。因此，须采取多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：①采用分泌型表达载体系统，使外源基因表达的蛋白质分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基中，避免细胞内的水解酶对表达蛋白的降解。②使目的基因表达为融合蛋白的一部分。融合蛋白形成的杂合构象，能在较大程度上封闭外源蛋白分子上的水解酶位点，从而增加其稳定性。③构建包涵体表达系统，外源基因的表达产物以包涵体的形式存在于受体细胞中，这种难溶性沉淀复合物不易被宿主细胞蛋白水解酶所降解。
④选用某些蛋白水解酶缺陷型菌株作为受体菌，这种细胞中具有较低水平的水解酶活性或完全丧失某种水解酶活性，可保证基因表达产物在受体细胞内的相对稳定。⑤对外源蛋白水解酶敏感的序列进行修饰或改造。
（5）减轻宿主细胞的代谢负担。外源基因在细菌中高效表达，合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的环节。
8.5表达产物的检测
8.5.1含有报告基因的融合蛋白表达的检测
报告基因编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体，鉴定基因表达状况，因而作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：①已被克隆和全序列已被测定；②表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；③其表达产物能进行定量测定。常使用的报告基因如荧光素酶基因（luciferase gene），该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可将表达载体用X 光片或专门仪器进行检测。绿色荧光蛋白（gfp）基因编码绿色荧光蛋白，该蛋白来源于海洋生物水母，其肽链内部第65～67位丝氨酸脱氢酪氨酸甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）及庆大霉素转移酶基因均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对宿主的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长。选用何种报告基因可根据其特性进行筛选。
8.5.2免疫技术
外源基因的表达蛋白的免疫检测多采用酶联免疫法（ELISA）与免疫荧光技术。其原理是将特殊的抗体结合在固体表面（如微孔板）上，加入样品，抗原与抗体结合，未被结合的成分被洗掉。通过带有酶的抗体来检测抗原，形成抗体抗原酶标抗体复合物，而未被结合的成分再次被洗掉，经过显色或荧光变化即可测定抗原的含量。检测抗原的另外一种方法是将样品（抗原）包被在固相载体上，然后与一抗结合，再加上与一抗特异结合的酶标二抗，使酶固定在抗原上，通过相同的检测手段测定抗原的含量。由于免疫技术通过酶反应的放大作用，所以检测灵敏度极高，且具有特异性，使得免疫技术在基因表达研究中处于很重要的地位。
8.5.3Western 杂交
Western 杂交的原理是从表达载体中提取蛋白质，经SDS‐PAGE 使蛋白质按相对分子质量的大小分离，再转移至固相膜上。依次加入特异抗体（一抗）与标记的二抗，根据二抗上标记的化合物的抗性进行检测。如果转化的外源基因正常表达，那么转基因植株中就会含有对应的目的蛋白。
总之，检测外源蛋白在大肠杆菌中的表达，还可以通过宿主细胞蛋白质的含量进行，根据所要表达的目的蛋白的特性，选用不同的方法。
本章小结
克隆的真核基因在大肠杆菌表达系统中正确表达的最基本条件是，能够进行正常的转录和转译、转译后正常地被加工成有生物活性的新生多肽。克隆的外源基因正确转录，需要置于能够被宿主细胞RNA聚合酶识别的启动子的控制下，在理想的条件下，还应在其3′末端具有转录终止子。基因表达过程中，除了转录，翻译也是非常重要的一步，翻译效率取决于mRNA上的核糖体结合位点。
表达载体是外源基因表达的关键，在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体须符合的条件是：①在宿主细胞中能自我复制；②含有大肠杆菌适宜的选择标记；③具多克隆位点，方便目的基因以正确的方向插入；④具有可控制的启动子；⑤在启动子下游区和ATG 起始密码子上游区有核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译；⑥在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性。
大肠杆菌中常用的启动子有Lac、Trp、Tac 以及来自λ噬菌体的强启动子PL、PR 和来自T7噬菌体的T7启动子等。根据启动子的不同，大肠杆菌表达载体有：Lac 启动子的表达载体、trp启动子和tac启动子的表达载体、PL 启动子表达载体、T7启动子表达载体。
外源目的基因在原核细胞中的蛋白表达形式主要有包涵体、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白等5种。外源蛋白有些在细胞质中表达，有些在细胞周质中表达，还有的则分泌到细胞外，各种表达形式各有利弊。进行融合蛋白表达的标签有：6x His Tag、β半乳糖苷酶融合蛋白、trpE 融合蛋白、谷胱甘肽S 转移酶（GST）、融合蛋白以及硫氧还蛋白（Trx）、融合蛋白等。
要提高外源基因的表达效率必须满足以下条件：①外源基因的有效转录；②转录的有效延伸和终止；③有效的翻译起始；④选择有效的终止密码；⑤外源蛋白稳定而不被降解。对于表达产物的检测，可以采用报告基因的生化反应、蛋白的酶联免疫法和Western杂交等方法。
思考题
1.原核表达载体有什么特点？
2.什么是包涵体？ 如何避免形成包涵体？
3.如何提高外源基因的表达效率？
（张海燕）
