酵母菌（Yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物，并非系统分类单元，分属于子囊菌纲（子囊菌酵母）、担子菌纲（担子菌酵母）和半知菌类（半知菌酵母）。目前已知有1000多种酵母菌。根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌；不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。如果说大肠杆菌是外源基因表达最成熟的原核生物系统，那么酵母菌则是外源基因最理想的真核生物表达系统。
近年来，随着丝状真菌转化技术的迅猛发展，许多丝状真菌被应用到工业、农业、医药行业中，生产出了许多真菌或非真菌来源的重组蛋白，如葡糖淀粉酶（glucoamylase）、牛凝乳酶原（ bovinechymosin)、人体乳铁蛋白（ human‐lactoferrin)、鸡蛋清溶菌酶（ heneggwhitelysozyme）和人体白细胞介素6（humaninterleukin‐6）及甜味蛋白（thaumatin）等。
9.1酵母菌的基因工程
酵母菌的基因工程作为一个真核生物表达系统，相对于应用成熟的原核生物基因工程而言表现出一些优点，具体体现在以下几个方面：①基因表达调控机制比较清楚，遗传操作相对较为简单，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；②具有原核生物无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；③能将外源基因表达产物分泌至培养基中；④不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；⑤大规模发酵工艺简单而成熟，成本低廉；⑥酵母菌是最简单的真核生物，利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。因此，酵母菌的基因工程具有极为重要的经济意义和学术价值。
9.1.1酵母菌的宿主系统
酵母菌的种类繁多，但不是所有的酵母菌都可以发展成基因表达系统的宿主。能够发展成基因表达系统的宿主应具备一定的条件，如安全无毒、不致病，遗传背景清楚、容易进行遗传操作等。目前已广泛用于外源基因表达的酵母菌有：酵母属（如酿酒酵母，Saccharomycescerev isiae）、克鲁维酵母属（如乳酸克鲁维酵母，K luyveromyces lactis）、毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母，Pichia p astoris）、裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母，Schizosaccharomyces pombe）以及汉逊酵母属（如多态汉逊酵母，H ansenula polymorpha）等。
1.酿酒酵母
酿酒酵母是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌，它具有许多宿主菌必须具备的条件，并且人类对酿酒酵母的利用有相当长的历史，因此它的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
与原核细菌相比，酿酒酵母作为外源基因表达受体菌具有很多突出优点：
（1）提高重组异源蛋白的合成产物。
利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。由于呼吸链缺陷型的胞质突变株很容易分离筛选，因此具有更大的实用性。例如，携带SSC 遗传位点（超分泌性）的显性突变和两个SSC1和SSC2基因的隐性突变的酿酒酵母突变株是第一个被筛选鉴定的突变株，能提高重组异源蛋白的分泌产率。
研究表明，尽管SSC显性突变基本上与基因的启动子和分泌信号功能无关，但是SSC1和SSC2的隐性突变则具有一定程度的累加性，能显着提高凝乳酶原和牛生长因子的分泌水平；而另一个突变株不仅能高效分泌重组人血清白蛋白，也可大大促进α1抗胰蛋白酶和纤溶酶原激活剂抑制因子的表达。许多突变株可提高人溶菌酶在酿酒酵母中的表达与分泌，但其影响机制也呈多样性。例如，SS11突变株通过影响由羧肽酶催化的蛋白加工反应而提高表达产物的分泌产率；而在一个呼吸链缺陷的细胞质突变株（rho－）中，人溶菌酶的高效表达主要表现在转录水平上，而且相同的结构基因在不同的启动子（如PGAL9、PGAPDH、PPHO5和PHIS5）控制下，均表现出不同程度的高效表达特征，也就是说，rho－突变株能促进宿主染色体和质粒上许多基因的高效表达。
（2）具有完整高效的异源蛋白修饰系统，尤其是糖基化系统。
酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，然而这恰恰也是它作为受体菌的一个缺点，因为在野生型酿酒酵母中，分泌蛋白的糖基化程度很难控制，筛选和分离在蛋白糖基化途径中不同位点缺陷的突变株能有效地解决酿酒酵母的超糖基化问题。
在真核生物中，分泌蛋白的糖基化反应在两种不同的细胞器中进行：糖基核心部分在内质网膜上与蛋白质侧链连接，而外侧糖链则在高尔基复合体中加入。酿酒酵母对重组异源蛋白的糖基化作用与其他高等真核生物不同，但一般来说更接近于哺乳动物系统。目前已从野生型酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn 突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg 突变株以及外侧糖链缺陷型的och 突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式。含有mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的α1，6甘露糖基转移酶活性，而och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其他类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。人α1抗胰蛋白酶基因、酿酒酵母性激素加工的蛋白酶基因（BAR1）以及人组织型纤溶酶原激活剂编码基因在酿酒酵母mnn9和och1突变株中的活性表达，充分显示了其理想的抗超糖基化效应。
（3）减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用。
由于异源蛋白在受体菌中或多或少会表现出不稳定性，因此不管采用哪种受体菌，蛋白降解作用始终是外源基因表达过程中不容忽视的影响因素。尽管目前对重组异源蛋白在受体细胞中的降解机制还不甚了解，但泛蛋白因子（ubiquitin）依赖型的蛋白降解系统在真核生物的DNA修复、细胞循环控制、环境压力响应、核糖体降解以及染色质表达等生理过程中均起着十分重要的作用。
泛蛋白因子是一种高度保守并分布广泛的真核生物多肽，由76个氨基酸残基组成。在泛蛋白因子依赖型的蛋白质降解途径中，这个蛋白因子的C 端Leu‐Arg‐Gly‐Gly 序列首先与各种靶蛋白的游离氨基基团形成三种不同结构形式的共价结合物，这些共价结合物在泛蛋白激活酶E1、泛蛋白运载酶E2以及泛蛋白连接酶E3的作用下，最终降解为短小肽段直至氨基酸。因此减少泛白因子的浓度，就能减少重组异源蛋白的降解。
在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子，UBI1和UBI2编码融合蛋白泛蛋白CEP52，UBI3编码泛蛋白CEP76，而UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子。UBI1、UBI2和UBI3基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，UBI4的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。酿酒酵母的UBI1和UBI2基因分别定位于第九号和第十一号染色体上，而UBI3和UBI4则定位于第十二号染色体上。此外，几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（UBC）也已克隆鉴定，这些基因编码产物大多与E2蛋白质同源。根据其活性也可分为两大类：第一类基因包括UBC4、UBC5和UBC7，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其他区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于E3蛋白的存在；第二类基因包括UBC1、UBC2、UBC3和UBC6，它们的表达产物具有天然的C 端延伸活性，不需要E2蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。
在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长，但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因表达受体。编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测不出泛蛋白外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突变株是致死性的，但编码UBA1蛋白的等位突变株却可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。此外，上述六个UBC 基因的突变也是构建重组异源蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，例如，一个带有UBC4UBC5双重突变的酿酒酵母突变株对特异性短半衰期的宿主蛋白以及某些异常蛋白的降解活性大幅度下降，如果这种突变株对重组异源蛋白也具有同等功效，那么也可用作受体细胞。
（4）有些蛋白酶的缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。
酿酒酵母拥有20多种蛋白酶，尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表达产物，但实验结果表明有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。例如，将大肠杆菌的lacZ 作为报告基因分别导入两株具有相同遗传背景的酿酒酵母菌中，其中一株含有编码空泡蛋白酶基因PEP4的野生型菌株，另一株则为PEP43突变株，后者空泡中蛋白酶的活性显着降低。
比较这两株菌中α半乳糖苷酶的活性，在同等试验条件下PEP43突变株中的α半乳糖苷酶活性明显高于PEP4＋的野生菌，而且在间歇式发酵罐中，PEP43突变株也能长到相当高的密度。
PEP4蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，MFα1人神经生长因子（hNGF）原前体的融合蛋白只能在pep4突变株细胞中进行正确地加工剪切，这说明PEP4蛋白酶或者细胞内其他一些被PEP4蛋白酶激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确加工剪切过程有关。由于PEP4蛋白酶定位在细胞的空泡内，上述这种人神经生长因子加工剪切的前提条件是：①在hNGF 加工剪切的内质网膜或高尔基复合体中存在着一种依赖于PEP4蛋白酶成熟作用的另一种蛋白酶，它直接参与融合蛋白的加工剪切；②融合蛋白首先定位于空泡中，然后分泌；③PEP4蛋白酶不仅定位于空泡内，而且也存在于内质网膜和高尔基复合体中。虽然PEP4蛋白酶对MFα1人神经生长因子原前体融合蛋白的加工剪切作用是否专一还是个未知数，但这种现象的存在至少有助于理解酵母菌中重组异源蛋白正确加工剪切的分子机制。
目前利用酿酒酵母为宿主系统表达了多种外源基因产物，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人类细胞集落刺激因子等。利用经典诱变技术对野生型菌株进行多次改良，酿酒酵母已成为酵母菌中高效表达外源基因尤其是高等真核生物基因的优良宿主系统。
但酿酒酵母在表达外源基因的过程中也存在一些缺陷：①在发酵过程中会产生乙醇，而乙醇在培养基中累积会影响酵母的生长代谢和基因产物的表达，尤其是进行高密度发酵时该效应更明显；②蛋白的分泌能力较差；③虽然能进行蛋白质的糖基化修饰，但是和高等真核生物相比所形成的糖基侧链太长。这种过度糖基化可能会引起副反应。
2.巴斯德毕赤酵母
面对酿酒酵母上述问题，人们一方面对其进行遗传改造，改善其特性，另一方面又开始从酵母菌这个巨大的生物资源中寻找更好的宿主。近年来被大家所熟悉，并已被广泛应用的巴斯德毕赤酵母就是其中成功的一个。
巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养菌，于20世纪80年代初开发获得，大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵母Y211430进行突变改造而来，在组氨酸脱氢酶基因（his4）处有一突变，用于转化后筛选重组菌株。
培养基中的甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶的高效表达，其代谢过程的乙醇氧化酶基因AOX1表达产物可在细胞中积累到很高的水平，表达蛋白的总量可达细胞总蛋白的30%。
