AOX1的启动子是一种可诱导的强启动子，利用该启动子可高效表达外源基因。目前一般选择组氨酸醇脱氢酶突变株作为受体细胞，利用该受体系统时对载体上携带his 标记基因的转化子进行筛选。此外，以AOX1启动子表达外源基因时必须选择AOX1基因缺失的突变株作为受体细胞，以阻断受体菌的甲醇代谢途径，使其丧失合成阻遏物的能力。相对于酿酒酵母来说，毕赤酵母的分泌表达能力更强，其实外源基因在细胞中为单拷贝，其表达效果也较为理想。
目前已有数十种重组异源蛋白在毕赤酵母中得到表达，如乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子和链激酶等。
巴斯德毕赤酵母比较好地互补了酿酒酵母的不足，但也应该看到它的缺点：①分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传改造困难较大；②不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，所以要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受；③发酵虽然能达到很高的密度，但是发酵周期一般较长。
3.乳酸克努维酵母
乳酸克努维酵母也是一种长期被人类利用的酵母菌，在工业上用它来发酵生产β半乳糖苷酶，其遗传背景比较清楚。某些载体可在该酵母中稳定保存下来，即使在没有选择压力的情况下大部分质粒载体也不会丢失。乳酸克努维酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，并且其表达水平和效果高于酿酒酵母系统。由于乳酸克努维酵母在分泌表达外源重组蛋白的过程中能形成正确的蛋白构象，因而利用该系统表达高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性。
目前已有多种外源蛋白在乳酸克努维酵母系统中得到表达，如人白细胞介素1和β牛凝乳酶等。
9.1.2酵母菌的载体系统
酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色体DNA上自主复制子结构（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起构建而成的。酵母基因表达系统的载体一般是大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。其细菌部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的复制起点序列和特定的抗生素抗性基因序列，供在大肠杆菌中进行增值和筛选；酵母部分包括与宿主互补的营养缺陷型基因序列或特定的抗生素抗性基因序列、编码特定蛋白基因的启动子和终止子序列。
1.酵母载体的基本结构
（1）DNA复制起始区 研究表明，酵母表达载体包含两类复制起始序列：一类是在大肠杆菌中进行复制的复制起始序列，另一类是由酵母菌种引导进行自主复制的序列。而后者通常是来自酵母菌的天然2u 质粒复制起始区及酵母基因组中的自主复制序列。复制起始区赋予酵母载体在细胞每个分裂周期的S 期自主复制一次的能力，将其与酵母菌染色体上的ARS序列进行比较，发现一个ARS 一致序列，长11个核苷酸：5′（A/T）TTTATPTTT（A/T）3′。
在自主复制序列的下游还有一个序列区，为DNA复制起始复合物的形成提供结合位点。这两个序列区共同组成DNA复制起始区。
（2）选择标记 选择标记是载体转化酵母筛选转化子时必需的构件。在酵母表达载体系统中的选择标记有两类：一类是营养缺陷型，它与宿主的基因型有关。宿主为营养缺陷型，表达载体提供其代谢途径所必需的相应的基因产物。另一类是显性选择标记，如G418和cycloheximide 等，它的优点是可以用于各种类型的宿主细胞（包括野生型酵母菌）并提供直观的选择标记。
（3）有丝分裂稳定区 酵母表达载体不同于原核生物的质粒载体，它在细胞内的拷贝数较低，但相对分子质量较大，相当于微型染色体，因此决定转化子稳定的一个重要因素就是如何保证表达载体在宿主细胞有丝分裂时有效地分配到子细胞中去。有丝分裂稳定区来源于酵母染色体着丝粒片断，它的主要作用就是当细胞有丝分裂时能帮助载体在母细胞和子细胞之间平均分配。除此之外，来自酵母2u质粒的STB片段也有助于提高游离载体的有丝分裂稳定性。
（4）表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，它由启动子、分泌信号序列和终止子等组成。酵母基因启动子的长度一般在1～2kb左右，在启动子的上游含有各种调控序列，如上游激活序列、上游阻遏序列和组成性启动子序列等。在启动子的下游存在转录的起始位点和TATA序列。TATA序列可被转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物，它决定了一个基因的基础表达水平。位于启动子上游的UAS、URS等序列分别与一些调控蛋白相结合，并与转录起始复合物相互作用，以激活、阻遏等方式影响基因的转录效率。
分泌信号序列是前体蛋白N 端一段长为1730个氨基酸残基的分泌信号肽编码区，主要功能是引导分泌蛋白在细胞内沿着正确的途径转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工和生物活性起到重要作用。由于酵母细胞识别外源分泌蛋白信号肽的效率较低，所以需要依赖酵母本身的分泌信号肽来指导外源基因表达产物的分泌。常用的分泌信号序列一般来自酵母本身分泌蛋白的信号序列，常用的有α因子前导肽序列、蔗糖酶和酸性磷酸酯酶的信号肽序列。
终止子是决定mRNA3′端稳定性的重要结构，酵母中mRNA3′端与高等真核生物类似，须经过前体mRNA的加工和多聚腺苷酸化反应。在酵母中这些反应都是偶联的，一般发生在基因3′端的近距离内，因而酵母基因的终止子序列相对较短，一般不超过500bp。
多数酵母菌株含有一种小的能独立复制的天然环状dsDNA，称为2u质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始位点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。ARS 片段长60bp，富含AT，有特征性保守序列AAAT（C）ATAAA，2u 质粒存在于酵母核质中，每细胞50拷贝，其基因能编码两个REP功能蛋白。在质粒拷贝数低的时候，REP促进质粒复制，维持2uDNA在酵母细胞中的稳定。
2.酵母载体的种类
酵母表达载体可以根据载体在酵母中的复制形式、载体的用途、载体表达外源基因的方式等来分类，其中载体在酵母细胞中的复制形式应该是酵母载体最重要的特性。如果酵母载体按此标准进行分类，一般可以把它们分为：整合型质粒载体（YIp）、附加型质粒载体（YEp）、自主复制型质粒载体（YRp）、着丝粒型质粒载体（YCp）、酵母人工染色体（YAC）。
（1）整合型质粒载体（YIp）该质粒不含酵母DNA复制起始区，而是含与受体菌株基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，不能在酵母中进行自主复制。它能有效地介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，将外源基因整合到酵母染色体上并随染色体一起进行复制。
一般地说，酵母染色体的任何片断都可作为整合介导区，但最方便、最常用的单拷贝整合介导区是营养缺陷型选择标记基因序列。整合型质粒与染色体DNA的同源重组主要有两种方式：单交换整合和双交换整合。单交换整合，即在整合位点附近将外源基因整合到染色体上，由于单交换整合时染色体出现局部双拷贝同源序列，所以在随后的细胞分裂周期中有可能因染色体DNA的同源重组而将外源基因从染色体上切割下来。但由于自然发生的同源重组频率很低，所以单交换整合转化子一般还是相当稳定的。双交换整合，是整合载体的一部分通过与染色体DNA的同源重组将两个整合位点之间的染色体DNA片断置换下来。其结果不会在整合位点附近形成同源序列的重复，进而避免了再次发生同源重组的可能性，所以双交换的转化子稳定性好；但要实现外源基因的高效表达，必须在酵母细胞内找到拷贝数很高的靶位点。
（2）附加型质粒载体（YEp）是利用酿酒酵母2μ 质粒的DNA复制有关的元件所构建，这类载体的转化效率很高，每微克DNA可得93～94个转化子。但是这类载体在没有选择压力时不能稳定存在。野生型2μ 质粒在酵母细胞中非常稳定，每个细胞中的拷贝数可高达60～90，这是因为2μ 质粒的复制除了需要ORI-STB 复制区外，还需要自己编码的rep1和rep2基因的配合等。另外，野生型2μ 质粒由于存在FLP‐FRT 位点特异重组系统，使它可以具有超越染色体DNA复制周期而增加DNA复制的机会，这是野生型2μ 质粒在细胞中拷贝数高的基础。初期的YEp 型载体仅含有2μ 质粒的ORI-STB 区，当它转化带有内源性2μ 质粒的宿主细胞时，质粒相当稳定，质粒拷贝数也较高。但是，当它转化不带2μ 质粒的宿主细胞时，载体就很不稳定，拷贝数也很低。这充分说明野生型2μ 质粒中其他编码基因的作用。
大量研究表明，2μ 质粒的SnaB Ⅰ位点附近为一非必要区。将构建酵母载体的所有其他构建都插入这个位点，就能保持2μ 质粒的完整功能，从而使其成为一个高稳定、高拷贝的YEp 型载体。
（3）自主复制型质粒载体（YRp）该质粒含有酵母基因组的DNA复制起始区、选择标记和基因克隆位点等关键元件。由于含有酵母基因组复制起始区，能够在酵母细胞中进行自我复制。载体的克隆位点序列来源于大肠杆菌的质粒载体，如pBR322等。这类载体的特点是转化效率高，并且每个细胞的质粒拷贝数可高达上百个。但由于质粒载体在细胞分裂过程中不能均匀地分配到子细胞中，因而即使在有选择压力的条件下，随着转化细胞不断地分裂繁殖，子代细胞中的YRp 质粒拷贝数也会迅速减少，最终经过多代的培养后，子细胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。如果在没有选择压力的条件下培养，丢失了载体的细胞会以每世代高达20%的速率累积。因此YRp 质粒载体很难用于工业生产中高表达外源基因。
（4）着丝粒型质粒载体（YCp）该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高质粒在宿主细胞中的稳定性。由于DNA的复制受到限制，细胞中质粒载体的拷贝数远不如自主复制型质粒载体，通常只有1～2个。这种质粒常用于构建基因文库，特别适用于克隆和表达那些多拷贝时会抑制细胞生长的基因。
（5）酵母人工染色体（YAC）该载体包含酵母染色体自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）、酵母菌选择标记基因以及大肠杆菌的复制子和选择标记基因等。
在酵母细胞中的YAC载体能够以线性双链DNA的形式存在，具有高度的遗传稳定性。由于YAC含着丝粒，在细胞分裂过程中能将染色体载体黏连，并避免在DNA复制过程中造成基因的缺失，因而保证了染色体载体在细胞分裂和遗传过程中的相对独立和稳定。在ade2基因赭石突变株中，SUP4标记基因的表达使转化子呈白色，而非转化子或SUP4基因不表达时菌落呈红色。将外源基因插入到YAC 载体的Sma Ⅰ克隆位点上后，则可灭活SUP4基因，获得红色的重组克隆子。YAC 载体可插入200～800kb的外源DNA片断，因此特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达的研究。
9.1.3酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序首先是在酿酒酵母中建立的，类似的方法也同样适用于非洲酒裂殖酵母和乳酸克鲁维酵母的转化。质粒进入酵母菌细胞后，或与宿主基因组同源整合，或借助于ARS 序列进行染色体外复制。这种特征与原核细菌颇为相似，但与包括真菌在内的其他真核生物有明显的区别，后者中的非同源重组占主导地位。操作简便的转化系统是酵母菌作为DNA重组和外源基因表达受体的另一优势。
1.酵母菌的转化程序
酵母的DNA转化方法有以下几种方法。
（1）原生质体法 由于酵母有结构复杂的细胞壁，所以最早用于酵母载体DNA转化的方法是原生质体法。其缺点是控制酵母细胞原生质体化的程度比较困难，转化效率不稳定。另外，做原生质体转化时间长、成本较高。
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在钙离子和PEG 的存在下，酵母菌原生质球可有效地吸收质粒DNA，转化效率与受体菌的遗传特性以及使用的选择标记类型有关。在无选择压力的情况下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%～5%。此外，将酵母菌原生质球与含有外源DNA的脂质体或者含有酵母菌大肠杆菌穿梭质粒的大肠杆菌微小细胞融合，也能获得较高的转化效率。但以Zeocin 为筛选标记的表达载体时，不宜使用原生质体法转化，因为Zeocin 对原生质体有致死性。
