（2）离子溶液法 由于原生质体法的局限性，人们相继建立了几种全细胞的转化程序，其中离子溶液法的转化率与原生质体法不相上下。Ito 等（1983）将酵母细胞进行各种离子溶液的处理，然后进行DNA转化，发现一价碱性阳离子Cs＋、Li＋能明显地增加外源DNA的吸入，首次实现了完整酵母细胞的DNA转化。这种方法的转化效率达93个转化子/mg DNA，对于一般的应用来说已经足够高了。另外，这种方法简便，容易掌握，所以很快被广泛采用。在此基础上，Chen 等（1992）建立了酵母转化的一步法。这种方法特别适用于处于静止期的酵母细胞的转化，使酵母转化的方法变得越来越简单。
（3）电穿孔法和粒子轰击法 电穿孔法和粒子轰击法最早用于植物细胞的DNA转化，后来证明也能用于酵母细胞的转化，其优点是转化效率最高，每微克DNA可产生95个转化子。
酵母菌原生质球和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，因为它对受电击的细胞的存活具有较大的副作用。电穿孔转化法与受体细胞的遗传背景以及生长条件关系不大，因此广泛适用于多种酵母菌属，而且转化率可高达95个转化子/μg DNA。此外，采用类似于接合的程序也可将原核细菌中的质粒DNA转移到酵母菌中，只是其接合频率比原核细菌之间的接合低9～90倍。
2.转化质粒在宿主细胞中的命运
双链DNA和单链DNA均可高效转化酵母菌，但单链DNA的转化率是双链DNA的9～30倍。含有酵母复制子结构的单链质粒进入受体细胞后能准确地转化为双链形式，而不含复制子结构的单链DNA则可高效地同源整合到受体菌的染色体DNA上；另一方面，酵母菌细胞中含有活性极强的DNA连接酶，但DNA外切酶的活性比大肠杆菌低得多，因此线型质粒或带有缺口的双链DNA分子均可高效转化酵母菌，甚至几个独立的DNA片段进入受体细胞后也能在复制前连接成一个环状分子。将人工合成的20～60bp寡聚脱氧核苷酸片段转化酵母菌，这些DNA小片段能整合在受体菌的染色体DNA的同源区域内。例如某一酵母菌突变株呈cyc－遗传特性，其CYC1基因的第四位密码子突变为终止密码子，将含有CYC15′端完整编码序列的寡聚脱氧核苷酸转化这株突变株，可筛选到cyc＋的转化子，这一技术为酵母菌基因组的体内定点突变创造了极为有利的条件。
除此之外，进入同一受体细胞的不同DNA片段，如果存在同源区域，也能发生同源重组反应，并产生新的重组分子。将外源基因克隆在含有一段酵母菌质粒DNA的大肠杆菌载体（如pBR322及其衍生质粒）上，重组分子直接转化含有酵母菌质粒的受体细胞，重组分子中的外源基因便可通过体内同源整合进入酵母菌质粒上，这种方法尤其适用于酵母菌载体因分子太大、限制性内切酶位点过多而难以进行体外DNA重组的情况。同理，含有酵母菌染色体DNA同源序列以及合适筛选标记基因的大肠杆菌重组质粒转化酵母菌后，借助于体内同源整合过程可稳定地整合在受体菌的同源区域内，YIp 整合型质粒就是根据这一原理构建的。同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，但在一般情况下，50%～80%的转化子含有稳定的整合型外源基因。迄今为止，许多基因工程酵母菌都是采用整合的方式构建的，如产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母工程菌等。
3.转化子的筛选
转化子筛选的主要目的在于能找出高效表达外源基因蛋白的克隆子。目前，用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有两大类：营养缺陷互补基因和显性基因。
营养缺陷互补基因主要包括营养成分的生物合成基因，如氨基酸（LEU、TRP、HIS 和LYS）和核苷酸（URA 和ADE）等，在使用时，受体菌必须是相对应的营养缺陷型突变株。这些标记基因的表达虽具有一定的种属特异性，但在酿酒酵母、非洲酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、白化假丝酵母（Candida albicans）以及脂解雅氏酵母等酵母菌种之间，种属特异性表达的差异并不明显。目前用于实验室研究的几种常规酵母菌属受体菌均已建立起相应的营养缺陷系统，但对大多数多倍体工业酵母而言，获得理想的营养缺陷型突变株相当困难，甚至不可能，为此在此基础上又发展了酵母菌的显性选择标记系统。
显性标记基因的编码产物主要是干扰酵母菌受体细胞正常生长的毒性物质的抗性蛋白，其中来自大肠杆菌Tn601转座子的aph 基因编码氨基糖苷类抗生素G418的蛋白（磷酸转移酶），这个基因能在酵母菌中表达，但其转化酵母菌的能力只及营养缺陷型标记基因的9%。
利用质粒上的营养成分作为标记基因互补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不添加任何筛选试剂的条件下维持转化子中质粒的存在，但这种筛选互补模式并不稳定，而且对选择培养基的要求也很高，在大规模传统发酵中普遍使用的复合培养基一般不能用作这种转化菌的培养。近年来发展起来的自选择系统是克服上述困难的一种有效方法。
酿酒酵母的一种srb 1突变株对环境条件极为敏感，它只能在含有渗透压稳定剂的培养基中正常生长，而在普通复合培养基中细胞会自发裂解。用含有野生型SRB1基因的自主复制型多拷贝质粒转化这种突变株受体细胞，则只有转化子能在不含渗透压稳定剂的普通培养基中生长，因此任何培养基均可用于转化细胞的筛选以及质粒的稳定维持。更为优越的是，含有SRB1标记基因的多拷贝载体能在受体菌中稳定复制80代以上。相对化学试剂或营养缺陷互补筛选程序而言，这种自选择系统具有更高的应用价值。
酵母转化较为复杂。只有外源基因整合到染色体上才能稳定存在，如果转化后的重组载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，那么这种转化子是不稳定的，重组载体极易丢失。5′AOX1，3′AOX1和His 位点为整合区。对于巴斯德毕赤酵母而言，重组可分为两种情况：一是单交换，即插入，外源基因通过重组插入到酵母染色体基因组His4位点或AOX1基因的上游或下游，AOX1仍然保留，得到的转化子表型为Mut＋，此种整合的成功率为50%～80%，而且这一整合过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中，形成多拷贝转化子；另一种情况是双交换，即替换，载体经酶切后，使其外源基因表达元件和标记基因的两端与酵母染色体AOX1基因被载体外源基因表达元件和标记基因所代替，因此酵母只能依赖AOX2基因编码的或活性较低的纯氧化酶进行甲醇代谢，这样得到的转化子表型为Muts，利用甲醇的效率很低，但它表达外源基因的效率高。双交换产生的转化子多为单拷贝。
一般情况下，对于胞内表达最好选择Muts 表型，因为Muts 表型转化子胞内纯氧化酶含量很低，有利于目的蛋白的纯化。对于分泌表达，应尽量选用Mut＋表型，它能正常利用甲醇生长，所以发酵培养时，更容易达到高密度，产量可能相对较高。但无论是采用单交换还是双交换，得到的His＋转化子中有一部分是假阳性，这是因为当载体的His4位点和宿主基因组His4位点发生同源重组时，不带任何其他载体的野生型His4基因也可以发生同源重组，此种概率约占His＋转化菌落的9%～50%；采用电激转化法时发生频率最高。
因此，只通过在不含组氨酸的培养基筛选是远远不够的，还需要利用PCR方法对少量转化子进行复筛，即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子。转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交进行，即把等量的不同转化子点在NC 膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经过变性、中和后，可与有外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张NC 膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。
9.1.4常用的酵母表达系统
最早成功地表达外源基因的宿主菌是大肠杆菌，但是它不能表达结构复杂的蛋白质；随后发展的哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白，但表达水平低，操作复杂，不易推广使用。酵母表达系统是在这种条件下迅速发展起来的，具有很多突出的优点，如拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。截至目前，它已成功地生产和分泌人类、动物、植物或病毒来源的异源蛋白，获得一些传统方法无法得到的异源蛋白。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也存在一些不足之处：①在翻译异源蛋白时，遗传和翻译的稳定性常常受影响，如点突变等。这可通过大量的基因拷贝数解决，因为突变会被大量的正常基因覆盖掉；②翻译产物不稳定，可以用液泡蛋白酶缺陷型来解决，以防止产物降解。③翻译中，翻译错误可通过对DNA修改来防止，如选用酵母偏爱的密码子以避免错误地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密码子而引起的翻译中断和移位，以提高正确产物的产量。④选择翻译后具有修饰能力的酵母以及合适的载体，得到有活性的成熟产物。
⑤生产分泌蛋白时，能够糖基化和形成二硫键，而且能在信号肽的引导下进行分泌，但KEX2蛋白酶除去α因子的前导肽序列常不够完全，导致分泌蛋白有一个过长的氨基末端。这可采用氨基酸末端间隔序列解决，在α因子的前导肽序列和产物之间加一个间隔序列，这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。⑥糖基化，酵母能进行N 糖基化，主要是甘露糖型，还会发生过度糖基化，导致潜在的免疫原性。改变表达宿主糖基化背景能使产生的糖蛋白符合要求，但由于每种糖蛋白的糖基化都不同，因而要分别测试所要表达的各种临床中使用的糖蛋白。⑦ 蛋白折叠和分泌。有证据表明，有一些蛋白分泌后是错误折叠，滞留在内质网腔内。但目前对腔内蛋白在折叠和分泌中的作用还不清楚，这将是阻碍发展酵母表达系统的一个难题。
随着现代分子生物学技术的发展，人们将进一步探索各种酵母表达系统的强启动子元件、分泌信号肽以及对外源蛋白表达、分泌的影响因素。酵母表达系统在未来的发展和应用中占有重要的地位。
1.酿酒酵母（Saccharomyces cerev isiae）表达系统
酿酒酵母又名面包酵母，是迄今为止人们了解最完全的真核生物（其全部序列的测定已于1996年完成），也是人们最先建立的酵母表达系统，一直以来被称为真核生物中的“大肠杆菌”。1981年Hitzemom 等在酿酒酵母中表达了人α干扰素，开始将酿酒酵母表达系统推向了应用开发，此后酿酒酵母已被广泛地用作外源蛋白表达的宿主，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等，并发展了许多相应的表达系统。人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白。长期实践已证明，酿酒酵母具有较高的安全性。
由于酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型载体如pYES2，可在细菌宿主中进行选择和增殖，常使用pUC 质粒的复制起点和氨苄青霉素抗性选择标记。通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列（ARS），能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。为了克服这些载体的不稳定性，以脆弱的srbl 1突变的宿主作为基础建立自然选择系统。这个菌株要求渗透压稳定，否则会裂解，转化后带野生型SRB 的自主复制YEp 型质粒与此菌株进行互补，可在培养基上保持选择性。
整合型质粒不含ARS，如pHBM370不能在酵母中进行自主复制，而是利用同源片段将载体整合到染色体上，随染色体的复制而复制。这类载体稳定性高，但是拷贝数很低，但采取一些措施可以初步解决这个限制问题：①用酵母转座子易产生多个插入拷贝；②将reDNA插入到核糖体DNA簇中，在宿主的Ⅻ 号染色体上以150串联重复序列存在。用特殊的质粒如pMIRY2转化可产生上百个整合拷贝，整合的pMIRY2在无选择压力下分裂时保持稳定。
