在表达时，外源基因与来自酿酒酵母的高效表达基因启动子融合，这些启动子既有组成型表达，也有诱导型表达。启动子PGAL1在存在半乳糖的条件下表达水平提高900倍，诱导表达的GAL1、GAL7及GAL9基因产物占细胞总蛋白的0．5%～1．5%，是常用的启动子。酿酒酵母可指导外源蛋白分泌，通常是将重组蛋白的成熟蛋白形式与酵母α交配因子前导序列融合，该引导序列可用Kex2酶的蛋白水解作用切去，这个步骤是广泛存在于真核生物中的。
值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端α13甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗（如HBV 疫苗、口蹄疫疫苗等）。
应用酿酒酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致，酿酒酵母大规模发酵过程中会产生乙醇，难以进行高密度培养，分泌效率低，一般不能高效分泌相对分子质量大于30000的外源蛋白质。面对酿酒酵母上述问题，人们一方面对其进行遗传改造，改善其特性，另一方面又开始从酵母菌这个巨大的生物资源寻找更好的宿主。因此，许多新的酵母表达系统也发展起来了。
2．甲醇营养型酵母表达系统
甲醇营养型酵母是能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶Ⅰ（AOX1）、二羟丙酮合成酶（DHAS）、甲酸脱氢酶（FMD）等，是近些年来发展起来的一类外源基因表达系统，涵盖假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、和球拟酵母4个属。其中，巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母是主要用作表达宿主的甲醇型酵母。
（1）巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统是一种外源蛋白的高效表达系统。20世纪60-80年代Koichi Ogata 发现了巴斯德毕赤酵母可以利用甲醇作为碳源和能源；Pilips Petroleum 公司开发了毕赤酵母的高密度培养技术；随后巴斯德毕赤酵母作为外源基因表达系统被开发出来：研究人员分离出了赤毕酵母中的醇氧化酶AOX1基因（包括AOX1的强启动子），构建了毕赤酵母载体，从此开始利用此表达系统进行了大量外源基因的表达。
目前已有20余种具有经济价值的重组异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中获得成功表达。甲醇能够迅速诱导巴斯德毕赤酵母合成大量的乙醇氧化酶。在巴斯德毕赤酵母中有2个基因（AOX1和AOX2）编码乙醇氧化酶，但在细胞中乙醇氧化酶的活力主要由AOX1提供。
AOX1严格地受甲醇专一诱导、调控且能高水平表达，当培养基没有甲醇存在时检测不到AOX1的表达，但以甲醇作唯一碳源时，AOX1能高水平转录，其mRNA可占总mRNA的5%以上，乙醇氧化酶可达到细胞可溶性蛋白的30%以上。因此，AOX1启动子可以用于调控外源基因的表达。虽然AOX2与AOX1有92%的同源性，其编码蛋白质97%的同源性，但AOX1基因的编码产物在氧化过程中起到主要的作用，AOX2提供的乙醇氧化酶的活力很低。
AOX1基因的表达严格受葡萄糖和其他碳源的阻遏，甲醇诱导不能迅速解除葡萄糖的阻遏，因此在用于外源基因表达时，先用甘油作碳源进行预培养，再转换到甲醇作唯一碳源的培养基进行诱导。巴斯德毕赤酵母的表达载体大多是利用AOX1启动子的强诱导性使它下游的外源基因易于调控，并具有很高的表达量。主要的巴斯德毕赤酵母表达载体有pPIC9K、pHILD2、pHILS1和pPICZα系列等，适合于胞内表达和分泌表达。
大量研究结果表明，巴斯德毕赤酵母在异源蛋白的分泌表达方面优于酿酒酵母系统。酿酒酵母细胞中的乙醇积累是导致重组异源蛋白合成不足的主要原因，而由AOX1启动子介导的外源基因高效表达足以以单一拷贝获得较为理想的表达率，但建立多拷贝整合型的重组毕赤酵母菌具有更大的潜力。转化的DNA重组片段在受体细胞内环化后，通过单一交叉重组过程的重复使外源基因多拷贝整合在染色体DNA上，这种多拷贝整合型转化子在受体细胞有丝分裂生长期间具有显着的稳定性，而且能够通过诱导作用进行高密度培养。由于多拷贝整合机制与外源基因的序列特异性无关，因此这一高效表达系统具有广泛的应用价值。
此外，当使用AOX1启动子在巴斯德毕赤酵母细胞中表达外源基因时，选择AOX1缺乏的突变株作为受体细胞能获得比AOX1＋野生菌更高的表达效率，因为野生型巴斯德毕赤酵母在甲醇培养基中生长期间能产生阻遏AOX1启动子的一种中间代谢产物，而这种阻遏物是由甲醇代谢基因控制合成的。AOX1基因的缺失从源头上阻断了受体菌的甲醇代谢途径，因此尽管其他甲醇代谢基因依然存在，但由于没有合适的前体分子，从而丧失了其合成阻遏物的能力。
目前使用的巴斯德毕赤酵母受体菌大多是组氨醇脱氢酶的缺陷株，这样表达质粒上的his标记基因可用来正向筛选转化子。尽管两个自主复制序列PARS1和PARS2已从毕赤酵母菌属基因文库中克隆并鉴定，但由此构建的自主复制型质粒在该菌属中不能稳定维持，因而通常将外源基因表达序列整合入受体细胞的染色体DNA上，构建稳定的毕赤酵母工程菌。
巴斯德毕赤酵母作为外源基因表达系统具有很多优点：具有目前已知最强的启动子——AOX 启动子，可用于调控外源蛋白的表达；能在无机盐培养基中快速生长，以进行工业化生产，高密度培养干细胞量可达90g／L 以上；产物既可胞内表达又可分泌表达，易于纯化；产物表达量高，最高可达十几克／升；整合性表达，菌株遗传稳定；与酿酒酵母相比，产物糖基化程度低，糖基化位点为Asn-X-Ser／Thr，与哺乳动物细胞相同，适合医用。
虽然巴斯德毕赤酵母有许多优点，但真正实现高表达还必须根据它的特点进行周密的设计和精心的实验才能达到，实现外源基因在巴斯德毕赤酵母中的高表达应考虑以下几个问题：
①拷贝数：整合型载体的表达与自主复制的质粒型表达载体不同，前者转化子中表达载体的拷贝数变化较大，后者比较稳定，所以实现整合型表达载体的高表达，拷贝数是一个重要因素。
野生型巴斯德毕赤酵母在甲醇诱导下，醇氧化酶蛋白含量可达细胞总蛋白的30%，所以一般认为只要有一个拷贝的AOX1基因剂量即可达到mRNA的最高水平，但事实并非如此。在HIV21的Env 基因表达中，随着整入的表达载体拷贝数的增加，mRNA的水平可增加2～3倍，所以在研究一个基因表达时要充分考虑到表达载体的拷贝数；②蛋白酶分解：在分泌表达中由于宿主蛋白酶的存在经常使表达产物不稳定，降低了表达量。在实际工作中一般采用下列方法防止产物降解：采用蛋白酶缺陷的宿主菌；降低发酵培养基的pH值，抑制蛋白酶的活性；在培养基中补加氨基酸或多肽以阻遏蛋白质降解；③发酵：在巴斯德毕赤酵母外源基因表达的发酵中，摇瓶发酵往往与发酵罐的结果差别很大，这是由于诱导条件对表达影响较大，而摇瓶的诱导条件又难以控制。
（2）多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母是一种耐高温甲醇酵母，最适生长温度为37～43℃。该系统内含有特殊的甲醇代谢途径，含甲醇氧化酶（MOX）、甲醇脱氢酶（FMD）和二羟丙酮合成酶（DNAS）几种特殊的酶；只有一个编码甲醇氧化酶的基因（MOX），其启动子是强诱导启动子，与其他醇氧化酶启动子不同，该启动子对葡萄糖的阻遏不敏感，在葡萄糖限制或缺乏的条件下，能够被甲醇诱导，因此从培养向诱导的转换非常容易，在实际应用中有很大的优越性，其表达量高于其他的酵母表达系统。该表达系统的整合方式与毕赤酵母不同，毕赤酵母通过同源重组进行整合，得到的重组子90%以上是单拷贝，通过筛选可以得到多拷贝重组菌，但拷贝数也不是很高。
多型汉逊酵母的表达载体含有宿主菌的HARS序列，通过自我复制引导外源基因非同源性整合到染色体，50%以上的重组子是多拷贝，可以获得拷贝数为90以上的重组菌株。表达载体也可以利用rDNA的重复序列引导外源基因整合到染色体上，从而获得高拷贝数的重组菌。多型汉逊酵母能够形成高拷贝数的重组子，可以把多个基因分别整合到染色体上共同表达，并筛选到各基因拷贝数合适比例的重组菌，使各基因在重组子中按预期的剂量表达，形成甲醇酵母代谢工程菌，使甲醇酵母细胞变成一个生物反应器，从而使甲醇酵母能够高效合成需要多种酶才能合成而其自身不能合成的药物等物质。
多型汉逊酵母具有遗传操作简单、外源蛋白产量高、易于工业化生产等特点，但由于大肠杆菌和其他酵母的外源基因表达系统已得到广泛关注，所以对其表达系统的研究相对较少，不如巴斯德毕赤酵母应用广泛。
3.其他酵母表达载体
乳克鲁维氏酵母是一种可以利用乳糖作为全部能源和碳源的真核微生物。乳糖存在时，与乳糖代谢有关的酶可大量被诱导。乳克鲁维氏酵母主要有两种类型的载体：pMIRK1和pDK1，稳定性均很好。目前已有人血清白蛋白、人白介素1β等利用此载体系统进行了表达。
A rxula adeninivorams 是近年来发现的一种酵母，1990年定名为Arxula 属。A．adeninivorams可以利用多种复杂有机物作为碳氮源，可以适应的最高温度为48℃，温度超过42℃时可形成菌丝体，42℃以下时出芽生殖，它可耐受20%浓度的盐。基于这些特性，A.adeninivorams 既可作为外源基因表达系统，又可以为其他酵母表达系统提供某些特殊合适的基因。它的外源基因表达系统也已建立。
酵母种类繁多，各具特色，已经开发作为外源蛋白基因表达体系的只是沧海一粟，所以它是具有巨大潜力和开发价值的一类微生物，还有待于科研工作者的继续努力，相信酵母表达体系今后在人类生存和发展中将发挥越来越大的作用。
9．1．5酵母菌的蛋白修饰分泌系统
不论是原核还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质需定位于细胞特定的区域，有些蛋白质合成后要分泌到细胞外，这些蛋白质叫做分泌蛋白。酿酒酵母只能将几种蛋白质（如蔗糖酶、酸性磷酸酯酶以及杀手毒素等）分泌到细胞外或细胞间质中，而脂解雅氏酵母则可分泌相对分子质量较大的蛋白质（如蛋白酶、酯酶和RNA酶等），但总的说来，酵母菌的蛋白分泌能力远不如原核生物芽孢杆菌的分泌系统有效。
1.蛋白质的分泌运输机制
在高等真核生物中，大多数分泌性蛋白质的运输线路是：内质网膜-高尔基复合体-泡囊-细胞表面。与高等真核生物相似，高度分化的细胞其结构在酵母菌蛋白分泌运输过程中起着重要作用。酵母菌蔗糖酶和酸性磷酸酯酶的分泌是在细胞分裂过程中进行的。分泌蛋白首先集中在胞芽结构中，然后通过膜融合作用将分泌蛋白转入分泌型泡囊中，泡囊再将蛋白质运输到细胞膜内侧，并在GTP 结合蛋白复合物的协助下，与细胞膜发生融合作用，将蛋白质释放至细胞周质中。整个分泌过程需要受到SEC 基因编码产物的参与。
外源基因表达产物能否分泌与其N 端有无信号肽以及糖基化修饰有关。对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或α配对因子（AFM）的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性较大。
2.信号肽的剪切
酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能，这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成和O及N型糖基化等，这对保证表达产物的天然活性是十分重要的。
比如，人基质金属蛋白酶9（hMMP9）有3个糖基化位点，颜春红等用巴斯德毕赤酵母表达系统表达获得了相对分子质量为92260的重组hMMP9，相对分子质量略大于天然hMMP9（91270），这是由于酵母中蛋白的糖基化方式与哺乳动物不同所致，但糖基化方式的不同并没有明显影响蛋白的活性。
