信号肽序列对异源蛋白的高效分泌表达起着重要的作用。酵母菌信号肽序列大都由15～30个氨基酸残基组成，保守性较低，其中含有3个不同的结构特征：N 端带正电荷的n 区、中间疏水残基的h 区和C 端极性的c 区。这3个特征序列的氨基酸残基的组成对蛋白质分泌效率起着重要作用。例如，卡尔酵母菌α半乳糖苷酶（MEL1）的两个突变性信号肽序列能使异源蛋白Echistatin 和人纤溶酶原激活Ⅰ型抑制因子的分泌效率提高20～30倍。其中一个突变簇将野生型信号肽N 端疏水区中的Phe 和Tyr 分别改为Arg 和Leu，另一种突变形式是将野生型信号肽5位上的Lys 改为Pro，后者是在各种信号肽中通常用来阻断α螺旋结构的常用残基，对信号肽酶的正确剪切起着重要作用。
除了信号肽序列及其构象特征外，受体细胞内信号肽剪切酶系的表达水平对异源蛋白的高效分泌也有很大的影响。在酿酒酵母细胞内，存在两种针对含有MFα1信号肽的重组异源蛋白前体进行剪切的酶系，即由STE13基因编码的二肽氨肽酶以及由KEN2基因编码的蛋白酶，它们分别作用于α因子前体分子中的Glu‐Ala 和Lys‐Arg 两个剪切位点。当含有MFα1信号肽编码序列的外源基因高效表达时，受体细胞中这两个剪切酶系的含量已不能满足要求，此时若将信号肽剪切酶基因与外源基因共表达，可以有效地促进重组异源蛋白的成熟，进而提高其分泌效率。例如，在含有MFα1信号肽编码序列和α‐TGF 融合基因的克隆菌中，转入KEX2基因并使其高效表达，则转化子分泌α‐TGF 的能力大幅度提高。
大多数巴斯德毕赤酵母表达系统都是利用来自S.cerev isiae 的α‐MF 前原信号肽。α‐MF前原信号肽由长19个氨基酸残基的前肽和66个氨基酸残基的原肽组成，后者含有3个相同N 糖基化位点和一个二烷内肽酶加工位点。信号肽的加工是在内质网中进行的，包括三个步骤：第一步是信号肽酶去除前肽；第二步是Kex2内肽酶在原肽的精氨酸和赖氨酸之间进行切割；第三步是Ste13蛋白谷氨酸丙氨酸重复序列进行切割。酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的三级结构可以影响信号肽加工效率。
酿酒酵母中能用于促进异源蛋白高效分泌的信号肽序列并不多，它们主要来源于由MFα1基因编码的多肽性激素α因子、蔗糖酶（SUC2）、可阻遏型酸性磷酸酯酶（PHO5）以及杀手毒素因子（KIL）等，其中α因子的信号肽序列最为常用，因为它能促进多种异源蛋白的高效分泌。然而，异源蛋白的性质不同，α因子信号肽序列的效率也有很大差异，从9g/L 到5mg/L不等，其主要原因是与α因子信号肽序列融合的异源蛋白编码序列对mRNA的稳定性、翻译效率以及新生多肽链的翻译后加工等过程也有很显着的影响，因此在重组异源蛋白一定的前提条件下，比较信号肽序列对异源蛋白分泌的效率才有意义。
3.分泌蛋白的糖基化
分泌蛋白的糖基化与蛋白质的生物活性有着密切的关系，如大多数用作药物的蛋白质其天然状态一般都是糖基化的。糖基化也有利于蛋白质的折叠，使蛋白质具有某种构象，而蛋白质的构象与蛋白质在体内的可溶性、稳定性及对特异受体的相互作用等多种特性有关，所以发生正确的糖基化是非常必要的。
（1）N 和O 糖基化 尽管酵母菌都拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰形式不同于高等真核生物，许多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而酵母菌的O 寡聚多糖链则由单一甘露糖残基组成；酵母菌糖蛋白的N 糖基外链的组成成分只有甘露糖，在动物细胞中，N 糖基外链除了含有甘露糖单体外，还包括N 乙酰葡萄糖胺、半乳糖、唾液酸等糖基，分别产生高甘露糖型、杂合型以及复合型3种寡聚多糖结构。
在酵母菌中，蛋白质糖基化修饰分为两个主要步骤：①在内质网膜内腔中的寡聚多糖核装配，该步骤在长萜醇磷酸酯（Dol‐P）上进行。首先须形成Dol‐PP‐（GlcNAC）2（Man）9（Glc）3的寡聚多糖核结构，然后将该结构翻转入内质网膜内腔中，加入相应的甘露糖和葡萄糖，最终形成的完整寡聚多糖核结构再转移到多肽链Asn‐X‐Thr 序列中的天门冬酰胺残基的N 原子上。Ser 和Thr 羟基上的O 糖基化则是由Dol‐P‐Man 分子提供的甘露糖。②高尔基复合体中的糖外链延伸，分泌蛋白进入高尔基复合体后，在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应。此外，在高尔基复合体中还会发生O 糖基侧链的延伸反应。这两个步骤是在一个庞大的糖基化修饰酶系参与下进行，其中相当多的编码基因已克隆并鉴定。
酿酒酵母的O 型寡聚糖是由1～5个甘露糖残基通过α12连接构成的，而在毕赤酵母中O 型寡聚糖由1～9个甘露糖残基通过α12、α13和α16连接。目前对于表达蛋白质和O 糖基化特定位点的氨基酸一致性尚未形成一致的认识，然而，当蛋白质中存在大量的丝氨酸或苏氨酸，或丝氨酸/苏氨酸残基附近有脯氨酸存在，以及在丝氨酸/苏氨酸残基附近氨基酸残基的电荷性发生改变时，都有可能促进O 糖基化。
N 糖基化是外源蛋白质中含有一致性序列Asn‐Xaa‐Thr/Ser（Xaa 代表任何氨基酸）时，毕赤酵母能在其天门冬氨酸残基上的酰氨氮进行糖基化。N 糖基化作用从内质网开始，在高尔基复合体中进一步加工修饰。酿酒酵母的N 糖基化识别位点和高等真核生物的完全一样，不过，酵母细胞中合成的糖链多为甘露糖残基，并且会形成过长的侧链，即所谓的过度糖基化现象。这类糖基化上的差别可能也会影响生物活性或引起过敏反应。为了改造酵母的糖基化形式，现阶段主要采取两种措施：①位点专一性突变，减少潜在的糖基化位点；②利用酵母的突变株，产生类似哺乳动物的高甘露糖型糖链。例如，过度甘露糖基化是绝大多数酵母菌株共有的特征。而一个甘露糖合成途径的双突变株mnn1mnn9，可表达非免疫原性、非过度糖基化的重组蛋白。
毕赤酵母表达的蛋白质的糖基化过程与酿酒酵母相似，但也存在差异。首先是前者的糖基化程度低，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8～14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基要短得多，这使表达的外源蛋白的构想更接近天然蛋白。其次是多糖的连接形式也不同，酿酒酵母核心寡糖含有末端以α13形式连接的多糖，这使其糖蛋白的抗原性明显增强，而在毕赤酵母表达的蛋白质的N 多糖中则以α16形式连接的，其免疫原性较低，有利于临床应用。此外，毕赤酵母表达的蛋白质N 糖基化的多糖大小相对一致，而酿酒酵母表达的蛋白质的多糖大小通常差异很大。
（2）糖基化对蛋白质产量及功能的影响 糖基化对酵母表达蛋白质产量的影响因蛋白不同而异，既有糖基化会提高或降低表达产量的报道，也有糖基化对蛋白质表达量无明显影响的报道。造成这种影响的原因目前尚不明确。同样，糖基化对酵母表达蛋白功能的影响也因蛋白的不同会造成三种情况，即增强功能、降低功能和对蛋白功能无明显影响，这与蛋白糖基化位点所处的部位有关。
重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中会产生超糖基化作用，这种超糖基化作用会产生许多不利影响，包括重组蛋白的生物活性下降或抑制以及蛋白质的免疫原性增加等。解决上述问题的方法有三种：①利用基因体外诱变技术封闭重组蛋白中的糖基化位点，从而在根本上避免酵母表达系统的超糖基化作用，重组人尿激酶原和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子采用这种方法取得了较好的效果。然而，如果异源蛋白本身含有糖基化侧链，而且糖链的存在是其生物活性所需的，那么这种封闭方法并不适用。②筛选受体菌的甘露糖生物合成突变株，例如酿酒酵母的mmn1突变株能合成不含α1，3糖苷键的N 和O 寡聚甘露糖侧链，从而消除了甘露糖糖蛋白严重的免疫原决定簇。mmn9突变株失去了超糖基化功能，只能合成缺少外链的N 糖基化蛋白质，这对于表达生产只含有寡聚多糖核的真核生物重组蛋白（如人α1抗胰蛋白酶）是非常有效的。但上述两种突变株的缺陷是在大规模发酵过程中生长缓慢。③选用其他的酵母菌表达系统，如巴斯德毕赤酵母、多型汉逊酵母以及非洲酒裂殖酵母等，它们的蛋白质糖基化修饰作用在大多数情况下更接近于哺乳动物。
9.2丝状真菌的基因工程
9.2.1丝状真菌
丝状真菌作为转化的宿主菌，有许多其他微生物如细菌、酵母等不可比拟的优点：①丝状真菌具有很强的分泌胞外蛋白的能力，而细菌表达的重组蛋白往往以无活性的、难溶的包涵体形式存在；②当细菌表达外源真核基因时，因其翻译和转录不同于真核生物，因此即便真核基因转入细菌，也有可能不表达，但丝状真菌不存在类似的情况；③丝状真菌能对表达蛋白进行正确的翻译后加工，包括肽链的剪切和糖基化等翻译后加工；④丝状真菌具有像细菌一样的快速繁殖能力和短的生活周期，比动植物的细胞培养要简单；⑤许多丝状真菌，如黑曲霉（A spergillusniger）、米曲霉（A spergillusoryz ae）等长期被用在食品工业，被公认是安全的；⑥丝状真菌具有成熟的发酵工艺和后处理工艺。因此，丝状真菌是良好的真核（attractive）异源基因表达系统。
丝状真菌中尤其是粗糙脉孢菌（ Neutos pora crassa）和构造曲霉（A spergillus nidulans)是研究真核生物遗传重组、基因结构和基因表达的模式系统。丝状真菌的生殖方式有有性生殖和准性生殖两种。有性生殖可以通过有丝分裂产生重组体，实现基因的遗传重组，准性生殖也是真菌的一种导致基因重组的过程，包括异核体的形成、二倍体的形成及单倍体化。
真菌的遗传物质包括5种成分：染色体基因、线粒体基因、质粒、转座因子等，丝状真菌的核基因组和线粒体基因组及其结构功能与高等真核生物类似，其单倍体通常含有6～8个线状染色体，基因组大小平均为2× 97～4× 97bp，基因中也含有内含子，但一般较短。其启动子序列与真核生物类似，在5′非编码区中具有CAAT 和TATA 盒，但有些基因不具有此典型特征，还含有上游激活序列及增强子。
真菌细胞中富含多糖等代谢产物，丝状真菌基因工程的第一步是核酸的分离。真菌的核酸酶、多糖和色素对核酸的分离影响很大，其标准分离程序如下：将冷冻的菌丝体在研钵中用玻璃珠研碎，加入500μl TES 缓冲液（20mmol/L Tris‐HCl，pH7.4，9mmol/L EDTA，9%SDSw /v）悬浮，然后与500μl TES 饱和的苯酚均匀混合，离心，水相用苯酚和氯仿各萃取一次，萃取液用乙醇沉淀，得到核酸粗提物。对于RNA纯化，可将上述核酸粗提物用DNase Ⅰ处理，37℃保温1h，反应液用苯酚萃取一次，然后用乙醇沉淀。对于DNA纯化，则先用250μl TE 缓冲液悬浮核酸粗提物，加入2.5μl RNase A（9mg/ml），37℃保温1h，反应液用苯酚萃取一次，氯仿萃取两次，然后在水相中加入150μl 5mol/L NaCl 和400μl 13%PEG6000，冰浴1h，离心，即得丝状真菌DNA。
9.2.2丝状真菌的DNA遗传转化系统
丝状真菌的DNA遗传转化系统主要涉及：①选择标记，如营养缺陷型、药物抗性、抗生素抗性、突变型表型；②外源DNA引入丝状真菌受体的方法；③转化的类型：转化DNA进入宿主细胞后，可独立于宿主细胞核染色体而自主复制，即复制型转化；或整合到宿主染色体一道复制，即整合型转化；④关于转化子遗传稳定性。
