1.真菌遗传转化系统的选择标记
真菌的转化载体一般都是以细菌来源的质粒为基础构建的载体。由于这些载体要在原核细胞和真核细胞中扩增乃至表达目的基因，为了检测转化后的瞬时表达情况，载体上一般要加入选择性标记。选择性标记还具有进一步确定遗传转化子及转化子遗传特性的作用。通常使用的选择标记主要有三类：
（1）营养缺陷型互补基因 营养缺陷型互补基因是通过转入的标记基因与受体细胞缺陷基因互补，使受体细胞表现野生型生长而作为选择标记的。由于使用营养缺陷型标记要求有特定营养缺陷型受体菌，因而限制了这一选择性标记的使用。目前，常用5氟乳清酸抗性来构造尿嘧啶营养缺陷型基因，因为其能与来自粗糙脉孢菌的pyr 4基因和来自构巢曲霉（A spergillus nidulans）的pyr 基因形成互补。此外，被用作丝状真菌转化的选择性标记基因还有编码色氨酸生物合成酶的trp1基因；类似于粗糙脉孢菌trp1基因的trp基因，编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的arg 基因；来自黑曲霉（A spergillus niger)和产黄青霉（ Penicillium chrysogenum）的trpC 基因；来自米曲霉（A sergillus oryz ae）和产黄青霉的pyrG基因等。
（2）碳源、氮源、硫源等营养基因 营养基因，包括amdS，niaD，MPI等也常常用作筛选标记。例如，含有amdS（编码乙酰胺酶基因，来源于A.nidulans）的菌株能在含有乙酰胺的培养基上生长，而其野生型不能在含乙酰胺的培养基上生长。如枯壳多孢（Stagonosporanodorum）的硝酸盐还原酶基因nia被克隆，并被用于构建一种依赖于硝酸盐同化作用的转化系统；甘露糖6磷酸异构酶（MPI）是来源于大肠杆菌的manA 基因，可以将不能为真菌所利用的甘露糖6磷酸转化为果糖6磷酸，当在培养基中只有甘露糖6磷酸作为唯一碳源时，只有含有M PI基因的转化组织或细胞可以生长，而未转化部分因为不能利用甘露糖6磷酸而停止生长，直至死亡。这些标记基因具有与受体细胞染色体同源的序列，可以插入受体细胞染色体上的特定位点，从而破坏该位点附近基因的表达而产生突变型表型。
（3）抗性基因 抗性基因的转入可以使受体细胞在一定的药物浓度下生长，表现出药物抗性，包括潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等。卡那霉素能与细菌的30核糖体亚单位结合，抑制翻译的起始，潮霉素可以与肽链延长因子EF 2作用，从而抑制肽链的合成。抗性基因是显性选择标记，使用十分方便，无需筛选突变株作为受体。
一般说来，丝状真菌可高效率转化同源和非同源的序列使其整合到基因组上。此外，丝状真菌一个有用的特征是能与不带选择性标记的质粒高效率地共转导，而且可以获得较高的整合型转化子。
2.丝状真菌的DNA遗传转化的方法
（1）CaCl2／PEG 介导的原生质体转化 许多丝状真菌采用CaCl2／PEG 介导的原生质体转化，因此制备高效的原生质体是进行转化的前提和基础，原生质体的状态对转化效率的影响很大。首先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子获得原生质体，然后将原生质体、外源载体DNA混合于一定浓度的CaCl2、PEG（聚乙二醇）缓冲液中进行融合转化，去掉PEG 则无转化发生，然后将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。
（2）根癌农杆菌介导的转化 Ti 质粒上的T‐DNA和vir（virulenece）区是农杆菌侵染植物所必需的。T‐DNA的转化依赖于Ti 质粒上一系列vir 基因的表达，而这些v ir 基因的表达受小分子的酚类和糖类物质的双重调节。用与基因组没有同源性的T‐DNA转化丝状真菌，可以使外源DNA插入基因组，标记的突变基因可以根据已知插入DNA序列，用质粒拯救或PCR方法克隆。若用同源基因转化，可发生同源重组，用于研究目标基因的功能。随着转化丝状真菌技术的不断成熟，根癌土壤杆菌介导的丝状真菌转化有单拷贝随机整合以及精确度高的特点，因此它有可能成为工农业生产中丝状真菌分子遗传学研究的重要手段之一。
（3）电转化 电转化是一种使用瞬间高压电，使细胞膜破裂，短时间内保持小分子DNA进入细胞内，被广泛用于将外源核酸转化或转染原核与真核细胞的有效方式。电转化技术在细菌和酵母中的应用较为广泛，真菌也有报道。在丝状真菌中也应用了电转化技术。
（4）限制酶介导的转化 限制性内切酶介导的DNA整合技术是通过转化而产生带有标记突变子的一项新技术。在转化混合物中添加限制性内切酶可明显提高异源整合的频率，其原因为限制性内切酶可识别受体基因组以及外源质粒的共同酶切位点，并在胞内实现切割和重新整合。限制性内切酶介导的转化需要根据实验来确定受体细胞、给定限制性内切酶以及外源质粒的最佳转化条件，以获得高的转化效率。现有的报道普遍证明限制性内切酶介导的转化方法因菌种不同，转化效率表现也不同。在构巢曲霉限制性内切酶中的转化效率可以提高20～60倍，线状质粒转化A.f umigatus 的效率比环状质粒提高5～9倍；在粗糙脉孢菌中转化率影响不大，有的甚至降低。
另外还有基因枪技术、醋酸锂法等。
3.丝状真菌的复制型转化和整合型转化
转化DNA进入宿主细胞后，可独立于宿主细胞核染色体外而自主复制（复制型转化），或整合到宿主染色体上而随宿主染色体一起复制（整合型转化）。
（1）复制型转化 复制型转化需要构建含有真菌复制子的复制型载体，已从多种丝状真菌的线粒体DNA或基因组DNA中分离到自主复制顺序（ars），如卷枝毛霉（M ucoCircinelloids）、布拉克须霉（ Phycomyceblakesleeanus）、米曲霉（A.oryz ae）、玉米黑粉菌（U.may dis）等。在丝状真菌体内获得能自主复制的重组质粒，这是通过非复制型载体与染色体DNA或线粒体DNA整合，获得受体菌能自主复制的顺序而形成重组质粒，这种重组质粒具有自主复制能力，目前，已在灰绿犁头霉（染色体DNA与非复制型载体的重组）、构巢曲霉（染色体DNA与非复制型载体的重组）、尖镰孢（染色体DNA的端粒顺序与非复制型载体的整合）、糙皮侧耳（染色体DNA与非复制型载体的重组）、花药黑粉菌（线粒体DNA与非复制型载体的重组）等丝状真菌体内获得复制型重组质粒。
（2）整合型转化 已实现转化的丝状真菌中，绝大多数都是整合型转化，在丝状真菌中存在着三种类型：第一种类型为转化DNA与受体染色体同源序列之间的重组，通过单交换导致转化DNA整合到染色体DNA上。第二种类型是转化DNA与受体染色体的异源重组，通过单交换导致转化DNA整合到受体染色体上。含有异源序列的载体和含有同源序列的载体均可产生异源重组，但含有同源序列的载体与受体染色体发生异源重组的比例较少。第三种类型是转化DNA与受体染色体同源重组，通过双交换导致转化DNA中的基因取代受体染色体中的基因。在丝状真菌中，第二种类型的异源整合转化是常见的，可能由于丝状真菌的异源整合转化不需要广泛的序列相匹配，因为整合连接处的核苷酸序列很少或没有同源性。不过，有关异源整合所需的最低程度的同源性尚未确定，这可能由于菌株或标记的不同而不同，也可能受目前尚不清楚的重复弥散顺序的分布的影响。总而言之，整合转化受多种因素的影响，如序列同源性的程度、转化DNA的构型、特异性选择标记、被转化的菌株种类，以及尚未确定的影响DNA断裂和修复的特异性基因及其产物的活性等。
4.丝状真菌转化子的遗传稳定性
（1）整合型转化子无性繁殖稳定性 转化子的遗传稳定性是其应用的一个主要标准，整合型转化中由于转化DNA整合到染色体DNA中，因此其稳定性应如同任一染色体基因一样稳定，但事实并非总是如此。转化子中的转化DNA片段在有丝分裂过程中是十分稳定的，如有研究表明构巢曲霉的argB 基因在50代以上的生长过程中仍未检测出丢失发生。有研究认为转化子的遗传稳定性可能也与转化方法有关。
（2）整合型转化子有性繁殖稳定性 转化子的减数分裂遗传稳定性通常是不规律的，有的研究没有检出转化DNA的丢失，而有的研究表明转化DNA丢失达36%以上。如有研究诱导黄枝孢（Cla-dosporiumfulvum）准性生殖循环中转化DNA的遗传时发现85个后代中，有80%的后代含有载体顺序，其中含载体顺序的后代中，有70%的后代对HygB 具有抗性，有8个后代的hph 基因失活，失活的原因是由于载体顺序的重新排列。
