（3）复制型转化子的稳定性 有人研究构巢曲霉自主复制转化的转化子无性繁殖遗传稳定性，在无氨基酸培养菌中生长的转化子所形成的分生孢中，有65%的分生孢子丢失转化DNA成Arg－；将Arg＋转化子在无arg 培养基中连续培养12代后，发现后代Arg＋表型仍不稳定，Arg＋后代的比例为35%～53%，Southern分析表明，Arg－后代均丢失了质粒ARp1，在ArgB＋转化子分别与ArgB－缺陷型菌株进行性杂交时发现，30%～61%的后代是Arg＋，这表明ARp1可通过有性循环而传递。
9.2.3丝状真菌载体质粒的构建
目前在丝状真菌基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒和自主复制型质粒两大类。前者转化各种丝状真菌受体菌均能获得稳定的转化子，相对整合型质粒而言，自主复制型质粒在丝状真菌中较不稳定，其转化仅在少数宿主系统中获得成功，主要原因是丝状真菌的多核生长状态强烈抑制自主复制型质粒在子代细胞中的等量分配。典型的丝状真菌载体质粒。
酵母菌的自主复制型质粒系统相当完善，但其自主复制序列（ARS）在丝状真菌细胞中并无活性。因此，寻找丝状真菌自己的A RS 是构建自主复制型质粒的关键。巢曲霉菌的自主复制型质粒ARp1（11.5kb）是由携带argB 基因的pILJ16载体DNA片段（5.4kb）与6.1kb 的巢曲霉菌染色体DNA片段A MA1重组而成的。ARp1转化巢曲霉菌的效率比野生型质粒pILJ16高250倍，而且这个质粒在硫曲霉菌（A spergillus oryz ae）和黑曲霉菌（A.niger）中也能自主复制，其转化率比pILJ16分别提高30倍和20倍。ARp1质粒上的A M A1DNA片段在其两端各含有一段短小的反向重复序列，该片段中部区域缺失并不影响ARp1的转化特性。
因此，ARp1的自主复制能力及其在宿主菌多核菌丝体中的稳定性仅与A MA1两端的反向重复序列有关。
显毛菌属的自主复制型质粒pRR12也已构建成功。其基本质粒为酵母菌整合型质粒YIp5，含有显毛菌属自身的A RS 活性片段以及来源于大肠杆菌Tn903转座子的卡那霉素抗性基因。但pRR12转化显毛菌属的转化率极低，只有20/μg DNA，但在选择压力存在下，可进行高拷贝稳定复制。从上述转化子中提取总DNA，再转化大肠杆菌，可分离出两种新的显毛菌属质粒pG121（6.3kb）和p126（3.1kb），它们都含有卡那霉素抗性基因、pBR322复制子以及一段来自显毛菌属内源性环状质粒pME（8.5kb）的DNA片段，其中p126是作为pEM 质粒的一部分在显毛菌属中自主复制并稳定遗传的。将大肠杆菌的lacZ 基因克隆到p126上所形成的重组质粒pSV7能直接转化显毛菌属，转化子在含有X‐gal和卡那霉素的平板上呈现白色和蓝色两种菌落，所有的蓝色菌落中都含有完整的pSV7；但当用pSV7重新转化大肠杆菌时，质粒发生重排，因此pSV7不能作为穿梭质粒使用。
在丝状真菌各种属中还发现了几种线粒体线状质粒，绝大部分的这种质粒在其5′端与一个蛋白质结合。将从赤壳菌属（Nectria）线型质粒pFSC1（9.2kb）上含有长末端反向重复序列（TIRs）的4.9kb H ind ⅢDNA片段克隆到美地黑粉菌质粒pIC19RHL 的相应位点上，构成自主复制型载体pTIR1。全长为1211bp 的TIR片段含有与酵母菌A RS保守序列几乎完全相同的同源序列（只有一个碱基差异），而且与美地黑粉菌383bp A RS 片段中的11bp 特征序列也有较高的相似性。用超螺旋的pTIR1转化美地黑粉菌，其转化率比线性pTIR1以及pIC19RHL 高3.6～21.7倍不等，所获得的潮霉素B 抗性菌落也比线型pTIR1或pIC19RHL转化子要小得多，且生长缓慢。从这些菌落中提取出的载体DNA与原始质粒完全相同，而从pIC19RHL或线型pTIR1转化子中分离出的质粒往往整合了一段DNA大片段。值得注意的是，超螺旋的pTIR1转化子中也有一部分生长迅速的菌落，其所含的质粒上同样带有高相对分子质量的宿主DNA片段。
另一类丝状真菌的线型载体质粒是两端含有染色体端粒序列的重组分子，如pPATura2等系列。用这类质粒转化相应的受体菌，大约有50%的转化子能自主复制并稳定遗传原始的线性质粒，而且不含宿主整合型区域。在选择压力存在下，受体菌每5～9个核中含有一个线状质粒分子，但在无选择压力时，这些非染色体分子迅速丢失。
在丝状真菌中，整合型质粒的转化频率相当低，一般每微克质粒DNA只能产生9～20个转化子。pFB6是一个颚突脉孢霉菌的整合型质粒，它含有颚突脉孢霉菌的复制子结构、pyrG标记基因，以及pBR325上的bla 抗性基因。将90个在酵母菌中具有ARS 功能的巢曲霉菌DNA片段克隆在pFB6上构建出的重组质粒分别转化巢曲霉菌，只有一个重组质粒的转化率比原始的pFB6提高90多倍，达到5× 93/μg 质粒DNA。这个重组质粒的克隆片段大小为3.5kb，命名为ans1，但它在巢曲霉菌体内并不具有A RS 活性，并且在转化之后，重组质粒上同样也整合了一个宿主菌的DNA大片段。巢曲霉菌的染色体DNA上含有多个ans 拷贝，大部分集中在染色体的中心粒附近，直接与高频转化特性有关的序列含有高达81%的AT 碱基对。
9.2.4外源蛋白在丝状真菌的表达
许多各种来源的信号肽序列可在丝状真菌体内发挥作用，并能准确切断形成成熟蛋白质，因此一般不需要将异源基因与丝状真菌自身的信号肽编码序列进行融合。例如，鸡蛋中的溶菌酶信号肽能在黑曲霉菌中高效介导蛋白质加工与分泌；将巢曲霉菌的葡萄糖淀粉酶信号肽取代溶菌酶信号肽，融合蛋白的分泌并没有任何改善。然而，也有不少例子表明信号肽序列对蛋白质分泌水平的影响：在巢曲霉菌中，小牛凝乳酶原基因与葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列融合，成熟蛋白质的分泌量比使用自身的信号肽要高；在凝乳酶原基因的前面插入11个成熟葡萄糖淀粉酶的密码子，则巢曲霉菌分泌凝乳酶的水平可提高5～6倍。相似的结果在黑曲霉菌中也被发现，将凝乳酶原基因与glaA启动子重组，两者之间分别插入glaA基因的信号肽编码序列、酶原编码序列以及成熟葡萄糖淀粉酶N 端前47个氨基酸残基密码子，并对各种转化子的mRNA合成及凝乳酶分泌水平进行比较，结果表明，蛋白分泌量最低的是同时含有凝乳酶和葡萄糖淀粉酶酶原肽段编码序列的重组子，而成熟的葡萄糖淀粉酶氨基酸残基的插入则能大幅度提高凝乳酶的产量。
糖基化修饰反应是异源蛋白加工的一个重要内容。丝状真菌具有完善的O和N糖基化修饰酶系，有些蛋白质同时具有这两种修饰位点（如瑞赛木霉菌的纤维二糖水解酶Ⅰ和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶）。黑曲霉菌葡萄糖淀粉酶的催化活性区域及淀粉结合功能域均呈高度糖基化修饰，而糖基化位点则集中在由72个氨基酸残基组成的Thr/Ser富集区域内。在丝状真菌中表达的异源蛋白，即使它们都含有潜在的糖基化位点，但最终能否糖基化还取决于其他因素。例如，在阿洼曲霉菌中表达的凝乳酶并不被糖基化修饰，但在与此菌种亲缘关系很近的黑曲霉菌中，重组凝乳酶发生了N糖基化反应。借助于DNA定点诱变技术在凝乳酶中再人工引入一个N糖基化位点，则突变蛋白在阿洼曲霉菌中可被糖基化修饰，而且该位点的糖基化还能使蛋白的分泌量至少提高3倍。天然的溶菌酶不含潜在的N糖基化位点，从体外引入N糖基化位点同样能使溶菌酶糖基化，但其分泌水平并没有明显的提高。
丝状真菌的蛋白糖基化修饰和多糖的加工都是在蛋白质的分泌过程中进行的，糖基侧链相对较短，而且主要由甘露糖组成。这些特征与高等真核生物相似，但明显不同于酵母菌。
本章小结
原核细胞（大肠杆菌）是首先成功地表达外源基因的宿主菌，但它不能表达结构复杂的蛋白质。相对于原核表达系统，真核细胞表达系统有许多优点，其中酵母菌和丝状真菌是近年来才迅速发展起来的具有诸多优点的表达系统，他们在表达外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简便的特点，而且具有哺乳类细胞翻译后加工和修饰的功能，从而表达有生物活性的外源蛋白。
本章详细介绍了酵母基因工程和丝状真菌基因工程在宿主载体、转化载体、表达载体和蛋白分泌修饰方面取得的一系列进展，阐明了真菌基因表达系统的原理及其应用。尽管目前真菌基因工程还有很多不够完善的地方，如表达的外源蛋白会形成聚合体从而影响产率，信号肽加工不完全以及内部降解等因素造成表达产物结构上有差异等等。要解决这些问题，就需要从各个环节进一步深入研究外源基因在真菌中的表达规律，同时还要通过包括代谢工程在内的各种手段对现有真菌宿主进行改造。相信随着人类对真核基因表达的分子机理了解的加深，克隆基因表达的成功率会越来越高。
思考题
1.举例说明酵母基因工程相对于大肠杆菌基因工程的优势与不足。
2.酵母表达系统的基因表达载体的组成种类有哪些？
3.酵母载体系统的基本结构是怎样的？
4.试述附加型表达载体和整合型表达载体用在表达外源基因上的区别。
5.酵母菌的转化方式有哪些？
6.丝状真菌的遗传转化方式有哪些？
（刘献）
