将从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，利用DNA重组技术整合到另一种植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予受体植物新的特性，如增加粮食作物的产量、表达新的药用蛋白质或改变蛋白质的组成，以及提高受体植物的抗病和抗逆性等。这种利用基因工程技术获得的新植物品种就是转基因植物。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，科学家们已在多种植物中实现了基因转移，包括粮食作物、经济作物、蔬菜、瓜果、花卉及泡桐、杨树等造林树种。在世界上已有多例转基因植物批准进入田间试验，有些转基因产品，如转抗除草剂大豆已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
植物基因工程技术主要内容包括：目的基因的分离、植物细胞的遗传转化和转基因植物的鉴定等。
10.1目的基因的分离和鉴定
植物基因分离方法都是依据基因的核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因编码的mRNA和基因的功能等基本特性创建的，在不同条件下运用这些特性的一种或者多种而产生了多种有效分离目的基因的策略。
10.1.1人工合成
通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，人工合成基因的DNA全序列。其优点是所合成的是单基因，能够根据需要合成突变基因，缺点是费用高。目前这种方法主要用于一些突变基因的合成等。
10.1.2序列克隆法
1.根据已知基因的序列
如果已经从植物或微生物中分离到一个基因，可以根据该基因的序列从亲缘关系较近的另一种植物中分离这个基因。分离方法主要有2种，一是根据已知基因序列设计一对寡核苷酸引物，以待分离此基因的植物核DNA或cDNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，并与已知基因序列进行同源性比较，确认是否为待分离的基因；二是用已知基因的保守序列制备探针，筛选待分离基因的植物核DNA或cDNA文库，再对阳性克隆进行测序，并与已知基因序列进行同源性比较，最后经转化鉴定是否为待分离的基因。利用这种方法已分离许多植物基因，如花形态建成有关基因等。
2.根据DNA测序结果
利用表达序列标签（expressed sequence tagging，EST）寻找新基因，即从组织或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆并进行5′端或（和）3′端部分序列（EST，约400bp)的测定。
通过检索Gene Bank 等数据库，就可了解所测序列及其氨基酸序列是否与已知序列具有同源性，从而发现新基因。
10.1.3功能克隆法
1.根据基因表达的蛋白质
根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物，利用抗体或核苷酸探针筛选核DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核DNA或cDNA进行PCR扩增。通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
2.根据基因的表型突变互补和反义mRNA技术
许多研究表明，植物的许多基因可与细菌和酵母的突变体互补，如来自拟南芥的cDNA文库可与酵母的8个营养缺陷突变体互补。因此，能够通过功能互补这一表型特点来克隆有关基因。陈受宜等利用大肠杆菌脯氨酸缺陷型菌株，采用营养互补缺陷法分离到黑麦、水稻与脯氨酸合成有关的基因片段。但利用此法分离基因需做大量转化工作，且转化细胞中突变体频率较低。反义mRNA技术是先建立能够反义表达的mRNA，然后获得转基因植株，根据转基因植株表型的变异，以鉴定某个基因的功能。
3.转座子或T‐DNA标签法
当转座子插入植物基因组某个基因或其邻近位置时，插入位置上的基因可能失活并诱导产生突变型，或在插入位置上出现新基因。通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。该法缺点是需要创建转座子插入突变库，并进行筛选鉴定。
与转座子功能类似的根癌农杆菌T‐DNA也可用来分离植物基因，T‐DNA能够从农杆菌中转移并稳定地整合到宿主基因组中，使整合位置上的基因失活或产生突变，通过T‐DNA上的标记基因就可检测突变位置，得到与T‐DNA相连的DNA片段。以此制备探针筛选野生型基因文库，就可得到与突变相应的完整基因。
4.图谱分离法
首先找到与目的基因紧密连锁的分子标记，再结合染色体步行和跳跃技术（ chromosomwalking and jumping)、酵母人工染色体（ yeast artificialch romosome，YAC）、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）和可转化人工染色体（ transformation competentartificial chromosome，TAC）等克隆技术达到分离和克隆基因的目的。
10.1.4差异表达分析法
1.mRNA差别显示法
该法建立在RT‐PCR的基础之上，其原理是基于绝大多数mRNA具有3′poly（A）序列，针对3′poly（A）及邻近的两个碱基可以相应地设计与之对应的引物，5′T10MN （其中M 为dG、dA 或dC，N 为dG、dA、dC 或dT），如5′T10AG 等，共计12种组合，这些引物可将所有mRNA反转录分为12组。同时，针对mRNA5′端设计数个任意引物，然后用1个5′端的随机引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，这个5′端引物将随机结合在cDNA上。因为来自不同mRNA的扩增产物是有差异的，通过比较不同组间的结果，可以挑选差异表达的条带。差异cDNA片段经Northern 杂交验证后用作探针就可从cDNA文库或基因组文库中筛选出完整基因。
2.抑制消减杂交法
抑制消减杂交法（suppressive subtractive hybridization，SSH）是一种以抑制PCR为基础的cDNA削减杂交法。抑制PCR是利用非目标序列两端的长反向重复序列在退火时产生一种特殊的二级结构，无法与引物配对而选择性地抑制非目标序列的扩增。SSH 的基本步骤是：提取2个待分析样品的mRNA并反转录成cDNA，用Rsa Ⅰ或H ae Ⅲ酶切，形成drivercDNA和tester cDNA；将tester cDNA分成均等的2份，各自连上不同的接头，将过量的driver cDNA分别加入2份tester cDNA中，使tester cDNA均等化。第1次杂交后，合并2份杂交产物，与新的变性单链driver cDNA退火杂交，杂交产物中除第1次杂交产物外，还产生一种新的具有两端接头的双链分子。用根据2个adaptors 设计的内外2对引物进行巢式PCR，使含2个接头的目的片段以指数形式扩增，无接头序列或含相同接头的长反向重复序列在退火时产生一种特殊的二级结构而无法与引物配对扩增，或者只含单个接头而呈线性扩增。
经过2次杂交2次PCR后，目的片段就得以富集分离，酶切去除接头的目的片段经Northern验证后，就可用作探针从cDNA文库或基因组文库中筛选出全长的cDNA或基因组DNA片段（基因）。
不同基因克隆方法和技术都有各自独特的优点和局限性，将不同方法有机地结合起来不失为快速有效的分离目的基因的良策。目前已有实验室将cDNA微阵列技术与SSH 相结合，作为SSH 产物的鉴定技术，对阳性差减产物进行快速、有效筛选。目前，大规模基因测序已经完成了多个重要物种的基因组序列分析，随着技术的进步，目的基因的分离也将向高通量方向发展，变得更加实用和快速。
10.2植物表达载体——启动子
目前已从动物、植物及微生物中分离到许多适用于植物表达载体构建的启动子。按作用方式及功能将这些启动子分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。这种分类大体上反映了它们各自的特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往会表现出其他类型启动子的特性。
10.2.1组成型启动子
目前使用最广泛的两个组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S 启动子和来自根癌农杆菌Ti 质粒T DNA区域的胭脂碱合成酶基因启动子（Nos）和章鱼碱合成酶基因启动子（Ocs）。其特点是：表达具持续性；RNA和蛋白质表达量也是相对恒定的；它们不表现时空特异性；也不受外界因素的诱导；从结构上看，大多数组成型启动子转录起始位点上游几百个核苷酸处存在六聚体基元序列TGACTG，其往往以重复形式出现并被6～8个核苷酸隔开，缺失及点突变分析指出六聚体基元序列的存在对维持CaMV 35S 启动子、Nos 启动子和Ocs 启动子的转录活性是必需的。目前已分离出了与六聚体基元序列相互作用的编码转录活化因子的基因。
1.Nos 和Ocs 启动子
Nos和Ocs启动子具有与植物基因启动子相似的共有序列。它们都含有与TATA盒同源的序列，该序列位于转录起点上游－30～－40处，在转录起点上游－60～－80处也有类似的CAT盒的序列。最近研究表明，Nos和Ocs启动子也具有一定的损伤诱导和激素诱导活性，另外还发现，Nos启动子的强度依组织部位及器官位置不同而变化，在老组织内通常比新生组织中强，在生殖器官内也随发育状态不同而变化。值得注意的是，Nos启动子在禾本科植物中几乎没有启动表达能力或表达能力很弱。由此可见，启动子的分类不是绝对的，在某种意义上取决于研究方式。
2.CaMV35S启动子
CaMV 35S 启动子来自花椰菜花叶病毒（CaMV），由于启动CaMV 基因组的一小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该转录产物的启动子称为35S 启动子（p35S）。35S启动子起始于CaMV 35S RNA转录起始点－941至＋208的Bgl Ⅱ片段，在位于CaMVDNA中的－46至－105区段存在增强子序列，该启动子包括TATA盒、CAAT 盒、倒转重复序列和增强子核心序列四个部分。增强子核心序列与动物的增强子相同，即GTGG/TITG。
但动物系统中的增强子是组织特异性表达，而35S 启动子是非特异性表达，这是一个有趣的现象，其原因尚未清楚。最近发现，35S 启动子可以划分为两个区域：A 区域（－90～＋8），主要负责在胚根及根组织内表达；B 区域（－343～－90）主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达。在B 区域内的增强子序列可以提高表达水平，如果35S 启动子中存在两个B 区将能使35S 启动子的活性提高10倍，对异源启动子也有作用。值得注意的是，对某些启动子，B 区起到一个表达的阻遏因子作用。35S 启动子－75处含有一个TGACGT 核苷酸的重复基元结构，如果这一序列突变，将引起转录因子与其结合力下降，导致启动子表达能力减弱。
关于上述启动子的表达强度已有了许多研究，p35S 比pNos 的转录水平高30倍，但是这种差异也受植物种类、受体细胞的生理特性等影响。例如，CaMV 35S 启动子在禾本科植物细胞内的表达强度仅为双子叶植物中的1%～10%。即使同一启动子、同一种植物，受体细胞的生理状态不同表达能力也有明显差异。因此，在植物基因工程中要根据不同的目的选择所需的启动子，以适合表达的要求。
近年来发现，CaMV35S启动子加上来自AMV（紫花苜蓿花叶病毒）的一段44bp的引导序列，可使其表达强度增加5倍。44bp序列是翻译增强序列。如果把加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结合构成一个复合串联启动子，则比未修饰的CaMV35S启动子表达强度增加20倍。
10.2.2组织特异性启动子
组织特异性启动子（tissue‐specific promoter）也称为器官特异性启动子（organ‐specificpromoter）。在这些启动子调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节（developmental regulation）的特性。组织特异性启动子除具有一般的结构外，同时往往还有增强子（enhancer）和沉默子（silencer）的一般特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。因此，这类转录调控序列与诱导型启动子有一定的共同点。
