在基因工程中，大量应用的是作用于核酸的酶。生物体内与核酸有关的酶很多，例如核酸聚合酶、核酸水解酶等。核酸酶类是基因工程操作中必不可少的工具酶，基因克隆的许多步骤都需要使用一系列功能各异的核酸酶来完成。本章主要介绍以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等为主的多种核酸酶的性质和用途。
2.1限制性核酸内切酶
2.1.1限制性核酸内切酶的发现
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。在20世纪50年代，人们在研究噬菌体的宿主范围时，发现在不同大肠杆菌菌株（例如K菌株和B 菌株）上生长的λ噬菌体（分别称为λ.K 和λ.B）能高频感染它们各自的大肠杆菌宿主细胞K 菌株和B 菌株，但当它们分别与其宿主菌交叉混合培养时，则感染频率下降。一旦λ.K 噬菌体在B 菌株中感染成功，由B 菌株繁殖出的噬菌体的后代便能像λ.B 一样高频感染B 菌株，但却不再感染它原来的宿主K 菌株，原因是大肠杆菌K 菌株和B 菌株中含有各自不同的限制与修饰系统，λ.K 和λ.B 分别长期寄生在大肠杆菌的K 菌株和B 菌株中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性核酸内切酶的特异性降解。
在降解过程中，偶尔会有极少数的外来DNA分子幸免而得以在宿主细胞内复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。这种由宿主控制的对外源DNA的限制（restriction）和对内源DNA的修饰（modification）现象称为宿主细胞的限制和修饰作用。
几乎所有的细菌都能产生限制性核酸内切酶。由于限制性核酸内切酶的发现，基因操作才成为可能。为此，在发现限制性核酸内切酶工作中做出突出贡献的科学家W.Arber、H.Smith和D.Nathans 荣获了1978年度诺贝尔生理学或医学奖。
宿主细胞的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的作用，一是保护自身DNA不受限制；二是破坏入侵的外源DNA，使之降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内，但是它必须被修饰成受体细胞的限制性内切酶无法辨认的结构形式，才能在宿主细胞内得以生存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。
2.1.2限制性核酸内切酶的分类
目前已经鉴定出三种不同类型的限制性核酸内切酶，M.Meselson 和R.Yuan（1968）最早从大肠杆菌的限制与修饰系统中分离到限制性核酸内切酶，这种酶后来被命名为Ⅰ型限制性核酸内切酶。Ⅰ型限制性核酸内切酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP 酶和DNA解旋酶四种活性，其切割作用是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。因此，Ⅰ型限制性核酸内切酶在基因操作中没有实用价值。
1970年，H.O.Smith 和K.W.Wilcox 首先从流感嗜血杆菌（ H aemophilus inf luenz ae）分离出第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶H ind Ⅱ。Ⅱ型限制性核酸内切酶仅需要Mg2＋，可识别双链DNA分子上的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生具有一定长度的DNA片段，因此在基因克隆中广泛使用。
Ⅲ型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限制与修饰双重作用，其中M 亚基负责位点的识别与修饰，R 亚基具有核酸酶活性，酶的切割作用需要ATP、Mg2＋和S 腺苷甲硫氨酸等辅助因子。切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同，在基因克隆中很少使用Ⅲ型限制性核酸内切酶。
2.1.3限制性核酸内切酶的命名以及识别特点
由于发现的限制性核酸内切酶越来越多，所以需要有一个统一的命名规则。H.O.Smith和D.Nathans 于1973年提议的命名系统已被广大学者所接受。他们提议的命名原则包括以下几点：
（1）用具有某种限制性内切酶有机体属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成酶的基本名称。例如大肠杆菌（ Escheri chiac oli)用Eco 表示，流感嗜血菌（ Haemophilusin fluenz ae）用Hin 表示。
（2）用一个写在右方的字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的宿主菌的种名右方附加一个标注字母，表示这是染色体外的成分。
（3）如果一种特殊的菌株中，具有几个不同的限制修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如，流感嗜血菌Rd 菌株的几个限制与修饰体系分别表示为Hind Ⅰ，Hind Ⅱ，Hind Ⅲ等，H ind Ⅲ是在H aemop hilus in fluenz ae（流感嗜血杆菌）的d 菌株中发现的第三个酶；EcoR I 表示在Escherichia coli（大肠杆菌）中的抗药性R 质粒上发现的第一个酶。
（4）有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称。限制性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。例如R.Hind Ⅲ表示限制性核酸内切酶，相应的甲基化酶用M.Hind Ⅲ表示。
但在实际应用中，限制性内切酶的系统名称R 常被省略。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别特点有以下方面：
（1）大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列长度为4～6个碱基对，一般富含GC。有少数限制性内切酶可识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有酶，如Not I（GCGGCCGC）。
（2）识别序列具有双重旋转对称的回文结构（palindromic sequence）。对称轴位于第三和第四位碱基之间；对于由5对碱基组成的识别序列而言，其对称轴为中间的一对碱基。
（3）大多数酶的识别序列严格，但有些酶的识别序列仅第一二位严格专一，例如，Hind Ⅱ可识别4种核苷酸序列：5′GTYRAC 3′，其中，Y 表示嘧啶碱基C 或T，R 表示嘌呤碱基A或G。
2.1.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式
大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部水解磷酸二酯键中3′位的酯键，产生3′端为羟基、5′端为磷酸基团的片段。切割后形成3种不同末端结构的DNA片段：①在识别序列的对称轴上同时切割，形成平端（blunt end），如Sma Ⅰ；②在识别序列对称轴的5′端切割，产生5′端突出的末端，如EcoR Ⅰ：③在识别序列对称轴的3′端切割，产生3′端突出的末端，如Pst Ⅰ。任何一种Ⅱ型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互补，因此这种末端称为黏性末端（cohesive end）。限制性核酸内切酶识别的靶序列与DNA来源无关，根据这一特性，我们可以将任意两个不同来源的DNA片段连接，构成一种新的重组DNA分子。
有些不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割位点相同或不同，其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶（isoschizomer）。例如H paⅡ与MspⅠ的识别序列和切割位点都相同（C ↓CGG），它们是一对同裂酶，Sma Ⅰ（CCC ↓GGG)和X maⅠ（C ↓CCGGG），识别序列相同，但切割位点不同，前者产生平头末端，后者产生黏性末端。
R＝G或A，Y：C或T，M＝A或C，K＝G或T，N＝A或T或G或C。切割位点用↓表示。
另外，还有一些限制性核酸内切酶，它们来源各异，识别序列也各不相同，但切割后产生相同的黏性末端，特称之为同尾酶（isocaudamer）。显然，由两种同尾酶切割产生的黏性末端可以彼此连接，如BamH Ⅰ（5G ↓GATCC3）与BglⅡ（5A ↓GATCT3）的酶切片段可以彼此连接起来。
Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但是作用不同。如EcoR Ⅰ限制性核酸内切酶与EcoR Ⅰ甲基化酶，两者均识别GAATTC序列，而前者能对G↓AATTC序列进行切割，后者的作用是使第二个A甲基化。
2.1.5Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件
在合适的温度和缓冲液中，在20μL反应体系中，1h完全降解1μg DNA所需要的酶量，称为一个单位的限制性核酸内切酶。加入的酶过量，其贮存液中的甘油会影响反应，而且许多限制性核酸内切酶过量可导致识别序列的特异性下降。当DNA酶切后不需进行进一步的酶反应时，可加入酚／氯仿抽提，然后乙醇沉淀，使酶终止反应。
限制性核酸内切酶切割DNA是基因重组技术中的重要环节，直接关系到整个实验的成败，因此在操作过程中，应注意下列问题：①浓缩的酶液可在使用前用1× 限制酶缓冲液稀释（不能用水稀释，以免酶变性），稀释的酶液不能保存过长时间，要尽快用完。②限制性核酸内切酶在含50%甘油的缓冲液中，于－20℃稳定保存。一般总是在其他试剂加完后，再加入限制性核酸内切酶。每次取酶必须使用新的无菌吸头。应尽快操作避免反复冻融。
2.1.6影响限制性核酸内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率在很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。DNA制剂中的其他杂质，如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠（SDS）以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性。应用微量碱抽提法制备的DNA制剂，常常含有这类杂质。为了提高限制性核酸内切酶对低纯度DNA制剂的反应效率，一般采用增加限制性核酸内切酶的用量，扩大酶催化反应的体积和延长酶催化反应的保温时间等措施。
2.DNA的甲基化程度
限制性核酸内切酶是原核生物限制-修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用便会强烈地影响酶的活性。通常从大肠杆菌宿主细胞中分离出来的质粒DNA，都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶，一种是dam 甲基化酶，催化GATC 序列中的腺嘌呤残基甲基化；另一种是dcm 甲基化酶。因此，从正常的大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA，只能被限制性核酸内切酶局部消化，甚至完全不被消化，是属于对甲基化作用敏感的一类。
为了避免产生这样的问题，在基因工程操作中通常使用丧失了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。哺乳动物的DNA有时也会带有5甲基胞嘧啶残基，而且通常是在鸟嘌呤核苷残基的5′侧。因此，不同位点之间的甲基化程度是互不相同的，且与DNA来源的细胞类型有密切的关系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核基因组DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当CCGG 序列中内部胞嘧啶残基被甲基化之后，Msp Ⅰ仍会将它切割，而Hpa Ⅱ（正常情况下能切割CCCG 序列）对此类的甲基化作用则十分敏感。
限制性核酸内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，这种特性在有些情况下具有特殊的用途。例如，当甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻时，就会抑制限制酶在这些位点发生切割作用，这样便改变了限制酶识别序列的特异性。另一方面，若要使用合成的衔接物修饰DNA片段的末端，一个重要的处理是必须在被酶切之前，通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。
3.酶切反应的温度
DNA消化反应的温度是影响限制性核酸内切酶活性的另一重要因素。不同的限制性核酸内切酶具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度是37℃，但也有许多例外的情况，有些限制性核酸内切酶的标准反应温度低于标准的37℃，例如SmaⅠ是25℃，ApaⅠ是30℃。消化反应的温度低于或高于最适温度都会影响限制性核酸内切酶的活性，甚至导致酶的完全失活。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性核酸内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些限制性核酸内切酶切割位于DNA不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差异。
