5.限制性核酸内切酶的缓冲液
限制性核酸内切酶的标准缓冲液的组分包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris·HCl、β巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，需要2价阳离子，通常是Mg2＋。不正确的NaCl 或Mg2＋浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。缓冲液Tris·HCl 的作用在于，使反应混合物的pH值恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大多数限制酶来说，在pH＝ 7.4的条件下，其功能最佳。
巯基试剂对于保护某些限制性核酸内切酶的稳定性是有用的，而且还可使其免于失活。在“非最适的”反应条件下（包括高浓度的限制性核酸内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2＋取代Mg2＋以及高pH值等等），有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性会发生改变，导致从识别序列以外的其他位点切割DNA分子。有的限制性核酸内切酶在缓冲液成分的影响下会产生所谓的“星号”活性。
2.2DNA连接酶
2.2.1连接机理
1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶（DNAligase）。DNA连接酶广泛存在于各种生物体内。在大肠杆菌及其他细菌中，DNA连接酶催化的连接反应是利用NAD＋（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能源；在动物细胞及噬菌体中，DNA连接酶则是利用ATP（腺苷三磷酸）作为能源。其催化的基本反应是将一条DNA链上的3′末端游离羟基与另一条DNA链上的5′末端磷酸基团共价结合形成3′，5′磷酸二酯键，使两个断裂的DNA片段连接起来，因此它在DNA复制、修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。
DNA连接酶催化的连接反应分为三步：①由ATP（或NAD＋）提供AMP，形成酶AMP复合物，同时释放出焦磷酸基团（PPi）或烟酰胺单核苷酸（NMN）；②激活的AMP 结合在DNA链5′端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键；③与相邻DNA链3′端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。
值得注意的是，DNA连接酶所连接的是切口（nick），无法连接裂口。另外，DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
2.2.2DNA连接酶的种类
已发现的DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶（又称T4DNA连接酶）和大肠杆菌DNA连接酶。
T4噬菌体DNA连接酶（又称T4DNA连接酶）的相对分子质量为68000，最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。T4噬菌体DNA连接酶可以连接：①两个带有互补黏性末端的双链DNA分子；②两个带有平头末端的双链DNA分子；③一条链带有切口的双链DNA分子；④RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连接。
由于T4噬菌体DNA连接酶可连接的底物范围广，尤其是能有效地连接DNA分子的平头末端，因此在DNA体外重组技术中广泛应用。
虽然两个完全断开的平头末端DNA分子在T4噬菌体DNA连接酶作用下可以连接，但是连接速度非常缓慢，因此需要回收大量的酶切片段。在平头末端连接反应中，若加入适量的一价阳离子和低浓度的PEG，可提高T4噬菌体DNA连接酶对平头末端的连接活性。
大肠杆菌DNA连接酶的相对分子质量为75000，需要NAD＋作辅助因子。大肠杆菌DNA连接酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接，它的适合底物是一条链带切口的双链DNA分子和具有同源互补黏性末端的不同DNA片段。
2.2.3DNA连接酶的反应体系
由于T4噬菌体DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平头末端，所以比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛。T4噬菌体DNA连接酶的活性单位有多种定义，较通用的是韦氏（Weiss）单位。一个韦氏单位是指在37℃，20min 内催化1nmol 32P 从焦磷酸根置换到γ，β32P ATP 所需要的酶量。
连接反应根据DNA片段的分子大小及末端结构，在12～30℃下反应1～16h。对于黏性末端一般在12～16℃之间进行反应，以保证黏性末端退火及酶活性、反应速率之间的平衡。
平头末端连接反应可在室温进行，并且需用比黏性末端连接大10～100倍的酶量。终止反应可加人2μL 0.5mol／L 的EDTA 或者75℃水浴10min。
2.2.4影响连接反应的因素
DNA片段的连接过程与许多因素有关，如DNA末端的结构、DNA片段的浓度和相对分子质量、不同DNA末端的相对浓度、反应温度、离子浓度等。
重组子的分子构型与DNA片段浓度及DNA分子长度存在密切关系。对于长度一定的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。DNA浓度增加，有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子。对于两个以上的DNA分子的连接，如载体DNA与外源插入片段，要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。
对于黏性末端，一般在12～16℃之间进行反应。平头末端连接反应的最适温度一般为10～20℃，温度过高（ ＞ 30℃）会导致T4噬菌体DNA连接酶的不稳定。
2.3DNA聚合酶
DNA聚合酶（DNApolymerase）催化以DNA为模板合成DNA的反应。它能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3′OH末端，催化核苷酸的聚合作用。根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow 大片段酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等；②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
目前，已从大肠杆菌中分离到三种不同类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。在大肠杆菌中，DNA聚合酶Ⅰ和DNA聚合酶Ⅱ的主要功能是参与DNA的修复，而DNA聚合酶Ⅲ与DNA复制有关。在分子克隆中常用的是DNA聚合酶Ⅰ。
DNA聚合酶Ⅰ也称为Kronberg 酶，是Kronberg 等于1956年发现的第一个DNA聚合酶。它具有3种活性，即5′→3′DNA聚合酶活性、5′→3′外切酶活性和3′→5′外切酶活性。
3′→5′外切酶活性的主要功能是识别并切除错配碱基，通过这种校正作用保证DNA复制的准确性。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的主要用途是通过DNA切口平移来制备杂交探针。在Mg2＋存在时，用低浓度的DNA酶Ⅰ（DNase Ⅰ）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性和聚合酶活性可以同时发生。外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。由于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ不能使断裂处的5′P 和3′OH形成磷酸二酯键而连接，所以随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口平移（nick translation）。如果在反应体系中加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针。
2.3.2Klenow 片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌蛋白酶处理后可切割产生两个大小片段，其中较大的片段具有聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，称为Klenow 片段或Klenow 聚合酶。较小的片段具有5′→3′外切酶活性，定位于酶分子的N 末端；Klenow 片段具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性。
在分子克隆中，Klenow 酶的主要用途是：①补平DNA的3′凹陷末端，包括带裂口的双链DNA的修复；②对带3′凹陷末端的DNA分子进行末端标记；③在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；④用于Sanger 双脱氧末端终止法进行DNA的序列分析。
与切口平移法不同，DNA末端标记并不是将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5′或3′）进行部分标记。在使用Klenow 酶进行DNA末端标记时，DNA片段应具有3′凹陷末端。Klenow 酶不能直接用于3′突出末端DNA的标记。
2.3.3T4噬菌体DNA聚合酶
T4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，相对分子质量为1140。具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而且3′→5′外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强，T4DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow 酶高100～1000倍。
T4噬菌体DNA聚合酶可以补平或标记带3′凹陷末端的DNA分子，还可进行平头末端或3′突出末端的双链DNA的标记以及特异探针的制备。另外，T4噬菌体DNA聚合酶还能将双链DNA的末端转化成平头末端。
2.3.4T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶
T7噬菌体DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，是所有已知的DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个酶。此外，T7噬菌体DNA聚合酶还具有很强的对单链和双链DNA的3′→5′外切酶活性，其活性约为Klenow 酶的1000倍。T7噬菌体DNA聚合酶在分子克隆中主要用于催化大分子模板（如M13噬菌体）的引物延伸反应，它可以在同一引物模板上有效地合成数千个核苷酸且不受二级结构的影响；也可类似T4噬菌体DNA聚合酶应用于DNA分子的3′末端标记。
