测序酶是通过化学修饰或基因工程方法对T7噬菌体DNA聚合酶进行改造的酶，它不具备T7噬菌体DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性，保留其聚合活性，具有很强的持续合成能力，是Sanger 双脱氧末端终止法对长片段DNA进行测序的理想用酶。
2.3.5Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是第一个被发现的耐热的DNA聚合酶，它最初是从极度嗜热的栖热水生菌（T hermus aquaticus）中纯化而来的。Taq DNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，需要Mg2＋作辅助因子，最适温度为75～80℃。由于Taq DNA聚合酶具有高度的耐热性，所以在分子克隆中主要是通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。
已从多种耐热菌中分离出耐热性更好的DNA聚合酶，如从T hermus thermophilus中分离出来的Tth DNA聚合酶，从T hermococcus litoralis中分离出来的“Vent”DNA聚合酶，从Bacillus stermophilus中分离出来的Bst DNA聚合酶等。
2.3.6逆转录酶
逆转录酶（reverse tranase）又称为RNA指导的DNA聚合酶。已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，现在常用的两种逆转录酶分别来自纯化的鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）和Moloney鼠白血病病毒（Moloney murine leukemiavirus，Mo MLV）。AMV逆转录酶反应的最适温度为41～45℃，最适pH为8.3。逆转录酶具有以下催化活性：①5′→3′聚合酶活性，逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；②RNA酶H 活性，能从5′或3′方向特异地降解DNA：RNA杂交分子中的RNA链。
在体外以mRNA为模板合成其互补DNA是逆转录酶的最主要用途。它可应用两种引物，一种是寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷，即oligo（dT），另一种是随机序列的核苷酸寡聚体。另外，逆转录酶还用于3′凹陷末端的标记、杂交探针的制备和DNA序列测定。
2.4末端脱氧核苷酸转移酶
末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）简称末端转移酶。末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作用，这种聚合作用不需要模板，反应需要Mg2＋，其合适底物为带有3′OH突出末端的双链DNA。对于平头末端或带3′OH凹陷末端的双链DNA和单链DNA，末端转移酶催化的聚合作用仍能进行，但需Co2＋激活，且反应效率低。
在分子克隆中，末端转移酶的主要用途是给载体和外源DNA分别加上互补的同聚体尾巴，以便两者在体外连接。末端转移酶的另一个用途是进行DNA的3′OH末端标记，标记物可以是放射性的，如α32P dNTP，也可以是非放射性的，如生物素11dUTP，它们可用于DNA序列分析、DNase Ⅰ足迹分析、分子杂交等实验中。
2.5S1核酸酶
S1核酸酶来源于米曲酶菌（A spergillus oryz ae），是一种高度单链特异的核酸内切酶。
它可用于切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端、在双链cDNA合成时切除发夹环结构等实验操作中。通常水解单链DNA的速率要比水解双链DNA快75000倍。这种酶需要低水平的Zn2＋激活，最适pH值范围为4.0～4.3。S1核酸酶作图（S1nuclease mapping）法在测定杂交核酸分子（DNA：DNA或DNA：RNA）的杂交程度、RNA分子定位、确定真核基因中内含子的位置、内含子与外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中，都是十分有效的工具。
当克隆的基因组DNA片段与细胞的mRNA混合时，DNA中的外显子序列与相应的mRNA之间通过碱基互补，形成杂合双链分子，而内含子序列仍保持单链，并突出成为环状。用S1核酸酶处理，该酶能水解所有的单链区域，结果得到一个因内含子被降解而带有切口的DNA：mRNA分子。再用碱处理破坏RNA链，回收的DNA片段就是该基因的编码序列，其大小和数目可通过琼脂糖凝胶电泳来判断，所以用这种方法可以测定内含子的大小。
2.6核酸外切酶
核酸外切酶（exonuclease）是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。按照酶对底物二级结构的专一性，将其分为三类：①作用于单链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ和大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ ；②作用于双链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、λ噬菌体核酸外切酶等；③既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶。
大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ 可以从单链DNA的两个末端降解DNA分子，产生短的寡核苷酸片段；对于带黏性末端的双链DNA，大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ 可将末端削平，变为平头末端。反应不需要Mg2＋。它主要应用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置。
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ对双链DNA具有高度特异性，可降解平头末端、3′凹陷末端及有切口的DNA，但不能降解单链DNA和带3′突出末端的双链DNA，要求Mg2＋或Mn2＋作辅助因子。核酸外切酶Ⅲ的主要用途是通过部分降解双链DNA片段，产生部分单链DNA区域，作为DNA聚合酶的模板。生成的DNA分子可以用作特异探针的制备。
Bal31核酸酶来源于埃斯波加纳互生单胞菌Bal 31（A lteromonas espej iana Bal 31），主要表现为3′外切酶活性，同时伴有5′外切及较弱的内切活性，需要Mg2＋和Ca2＋。对于单链DNA，具有特异的内切酶活性，可从3′OH末端迅速降解DNA，而5′端切割速率较慢。对于双链DNA，具有3′→5′外切酶活性和5′→3′外切酶活性，可从3′和5′两端切除核苷酸，其机理是以3′外切酶活性迅速降解一条链，随后在互补链上进行缓慢的5′端内切反应。
2.7T4噬菌体多核苷酸激酶
T4噬菌体多核苷酸激酶（T4phage polynucleotide kinase）来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。已在多种哺乳动物细胞中发现了多核苷酸激酶。该酶具有多种功能，例如T4噬菌体多核苷酸激酶可催化ATP 的γ 磷酸基团转移到单链或双链DNA或RNA的5′OH末端。另外，它还具有3′磷酸酶活性。T4噬菌体多核苷酸激酶能催化寡核苷酸的3′磷酸水解成为3′OH，底物可以是3′磷酸脱氧核苷、3′，5′二磷酸脱氧核苷和3′磷酸多核苷酸。
在实际应用中，主要是利用多核苷酸激酶能进行DNA或RNA的5′末端标记和在连接反应之前，使缺乏5′磷酸的DNA或接头磷酸化。
2.8碱性磷酸酶
常用的碱性磷酸酶有两种，一种来源于大肠杆菌，叫做细菌碱性磷酸酶（bacterial alkalinephosphatase，BAP）；另一种来源于小牛肠，叫做小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkalinephosphatase，CIP）。小牛肠碱性磷酸酶（CIP）的相对分子质量约为140000，是一种含Zn2＋的金属糖蛋白，由两个亚基组成。它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5′磷酸变为5′OH末端。
CIP 可在68℃10min 内加热失活或通过酚抽提变性失活，而BAP则不能。因为BAP对高温和去污剂的耐受性较强，故需要进行多次酚／氯仿抽提及凝胶电泳纯化DNA片段。此外，CIP 的活性比BAP高10～20倍，所以实验中一般选用CIP。
碱性磷酸酶的主要用途有：①5′末端标记前的处理；②去除DNA片段的5′磷酸基团，防止自身连接。
在载体和目的基因的重组过程中，如果载体与外源DNA是使用同一种限制性核酸内切酶消化的，则它们的连接产物有自身环化形式。为了防止线性载体的自身环化作用，必须在连接之前使用碱性磷酸酶处理，去除其5′末端的磷酸基团。通过碱性磷酸酶预处理线性载体，有效防止了载体的自身环化，提高了载体与外源DNA的连接效率，从而降低了细菌转化时的背景。
本章小结
催化DNA各种特异性反应的酶是分子生物学家进行DNA操作的基本工具。在分子克隆过程中，制备好目的DNA之后，下一步就是使用限制性核酸内切酶将待克隆的DNA片段切割下来，与特异性切割的载体在DNA连接酶作用下连接形成重组分子。这一系列操作不仅用到了限制性核酸内切酶和DNA连接酶，而且还需要DNA聚合酶、核酸外切酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶等的参与，以提高特异性DNA片段的连接效率。由于以上各种酶类的发现，特别是限制性核酸内切酶和DNA连接酶的应用，使不同分子之间的连接成为可能，而且分子克隆的方法不断创新，基因克隆工作更加简单，应用范围更广。除了基因克隆外，其他研究（如DNA的生化特性测定、基因的结构分析和基因表达调控研究等），也都要用到这些酶。可以说，几乎所有的DNA操作都离不开它们。
工具酶在基因工程中占据着极其重要的地位。
根据这些工具酶催化的反应类型，可将其分为四大类：①核酸酶，用于切割或降解核酸分子；②连接酶，可以把核酸分子连接起来；③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝；④修饰酶，能够给核酸分子添加或去除核苷酸或某些化学基团。有些酶兼有数种功能，如大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，除了能合成新的DNA分子外，还有DNA外切降解作用。
思考题
1.限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？
2.简述DNA连接酶的作用机制及其特点。
3.说明使用切口移位法进行DNA标记的原理及其步骤。
4.什么是S1核酸酶作图法？ 有何用途？
5.如何进行DNA片段的末端标记？
6.在基因克隆中，如何防止载体分子的自身环化作用？
（邹克琴）
