10.4转基因植物的筛选与检测
在外源基因导入受体的过程中，转化细胞与非转化细胞相比只占少数，两者存在竞争，而作为异种细胞的转化细胞的竞争力很弱，因此必须对转化细胞进行筛选。另外，外源基因的整合、表达机制非常复杂，转基因植物体内的DNA分子被人为地修饰改造，遗传性状也发生了改变，转基因植物在带来巨大效益的同时，在环境安全性和食品安全性两方面的安全性也受到了人们的关注，我国于2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度，凡是在中国境内销售的大豆、玉米及其制品若属转基因生物，必须进行标识，而各国政府建立的转基因标识制度能否顺利实行的关键就在于能否建立准确可靠的转基因检测技术。为了消除转基因产品的安全隐患，研究外源基因的整合机制、表达水平和遗传稳定性，必须对转基因植株中外源基因的特性进行检测。目前，转基因常用的检测方法有外源基因检测和外源蛋白质检测等，此外，对于一些特殊的转基因产品，如油类等只能通过色谱分析和近红外线光谱分析等方法进行检测。
10.4.1转基因植物的筛选
报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达，从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因的编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
在有选择压力的条件下，利用抗性基因在转化体内的表达，有利于从大量的非转化细胞中选择出转化克隆。目前使用的选择性试剂主要有抗生素类（如新霉素、卡那霉素、庆大霉素、G418等）、除草剂类（草甘膦）。
由于植物种类、品种以及外植体类型不同，通常要通过预备试验以确定最佳的选择试剂种类及浓度。选择试剂可以由低浓度到高浓度逐渐加大，另外，选择试剂有时可能对分化产生影响，可适当降低分化阶段的选择压，甚至除去选择压。选择剂的加入时机，也因转化方法、物种、外植体类型的差异而不同，过早加入选择剂，抗性基因尚未表达，转化细胞被选择性试剂抑制或杀死；过迟加入选择剂，未转化的细胞则可能逃避选择，导致出现嵌合现象或假转化体。一般来讲，应用农杆菌介导的遗传转化，在外植体与菌体共培养36h 至5d 加入选择剂；而基因枪法、电穿孔法等直接转化法，宜在转化后5～15d 加入选择剂。
10.4.2外源基因表达的检测
转基因技术的核心是对植物遗传物质进行人为改造，因此检测改造过的遗传物质是转基因检测最直接的方法。外源基因检测方法适用范围广、准确性高，其他的检测方法，如外源蛋白检测法对于含不表达或表达量低得不可测的目的基因的转基因产品以及深加工产品则无法检测，故实际检测中多采用外源基因检测，包括定性检测和定量检测。
1.外源基因的检测
（1）PCR检测转化植株
PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定。其中定性PCR已成为筛选转基因植物的主要方法。随着转基因技术所使用的启动子、终止子及各种选择标记的增加，研究者将多重PCR（multiplex PCR）应用到转基因植物筛选中，在优化PCR的条件时，如果要优化的因素较多，可考虑采用正交设计法筛选出最佳组合。如Permingeat 等（2002）仅用2对引物就可同时检测出5种转基因玉米中的Cry IA （b）和pat 基因。近年来，由于同一外源基因经常在不同的作物或同一作物的不同品种中使用，因而培育出许多含有相同外源基因的不同品种。研究发现，外源基因在重组过程中以特有的机制整合到基因组的单一序列中，并且结合位点（integrationsite）和边界序列是唯一的，因而可以将边界序列作为品种特异性鉴定的靶序列。此外，利用RAPD‐PCR技术，可以检测出对照植株与转化植株的带型差异，还可用该技术检测不同代植株间基因组的稳定性及后代的分离。
在定性PCR的基础上发展起来的定量PCR检测法，包括定量竞争PCR（quantitativecompetitive PCR，QC‐PCR）和实时PCR（real‐time PCR）。一般认为，QC‐PCR适用于衡量样品转基因成分含量是否达到或者高于1%限量值，而不是对转基因成分含量进行精确测定。
real‐time PCR是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法，其灵敏度高、污染小，是目前最有效的转基因植物产品的定量检测方法。与Southern分析相比，PCR检测DNA用量少，操作简单，成本低，能够检测目的基因的完整性。但PCR检测也存在缺点，DNA插入植物基因组后易发生重排，即使载体上的抗性基因能表达，目的基因也未必完整地存在于转化体中，从而造成检测结果的误差。
（2）分子杂交
点杂交是将提取DNA或RNA直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交，可以初步鉴定转化体中是否有整合的外源基因。但点杂交的特异性差，阳性植株还需进一步做Southern杂交验证。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术。利用Southern杂交，可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源DNA整合的位置及拷贝数、转基因植株F1代中外源基因的稳定性。Southern杂交准确度高，特异性强，但对实验技术条件要求较高。Northern 杂交是将试材RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Northern 杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上，用特定的DNA探针来检测RNA。Northern 杂交与Southern杂交相比，更接近于性状表现，被广泛用于转基因植株的检测，但RNA提取条件严格，不适于大批量样品的检测。
2.外源蛋白质的检测
绝大多数转基因植物都以外源结构基因表达出蛋白质为目的，可通过免疫分析技术对外源蛋白质进行定性定量检测。免疫分析技术具有高度特异性，即便有其他干扰化合物的存在，特异性抗原抗体也能准确地结合。由于蛋白质容易变性，蛋白质检测方法只适用于未加工的产品。另外，蛋白质检测方法也不适用于外源基因无蛋白质表达产物的转基因植物检测。
（1）酶联免疫吸附法
主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的特点。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量的多少直接相关，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。一般为定性检测，但若作出已知转基因成分浓度与光密度值的标准曲线，也可根据标准曲线，由未知样品的光密度值来确定此样品的转基因成分含量，达到半定量测定的目的。
（2）Western 杂交 是利用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物中各种蛋白质，随后将其转移到固相膜上进行免疫学测定，据此得知目的蛋白质表达与否、大致浓度及相对分子质量。
Western 杂交具有很高的灵敏性，可以测出粗蛋白提取物中小于50ng 抗原，在较纯的制剂中，可测出1～5ng 抗原。Western 杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果，能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。但此法操作繁琐，费用较高，不适于批量检测。
（3）抗性基因的酶活性检测 新霉素磷酸转移酶（NPT‐ Ⅱ）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、PPT 乙酰转移酶（PAT）的编码基因常用作报告基因。在转基因植物中，新霉素转移酶可以催化氨基糖苷类抗生素磷酸化，能够提高转化细胞对新霉素、卡那霉素、庆大霉素、G418等抗生素毒性的耐受能力。氯霉素乙酰转移酶（CAT）能使氯霉素丧失抗菌素活性，PPT 乙酰转移霉（PAT）是由bar 基因编码的，可使PPT 失去对植物的毒害。通过检测抗性基因的酶活性，可以应用于转化体的检测。
（4）荧光素酶活性检测 检测转化细胞中荧光素酶活性是一个简单、快速筛选转基因植物的有效方法。荧光素酶基因是一个灵敏的报告基因，检测的灵敏度比CAT 高100倍，而且没有背景。荧光素酶基因的最大特点是不损害植物，即在整体植物或离体器官内，基因产物都可测定。但荧光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累，在植物体内产生光的部位不一定能反映荧光素酶基因的特定表达部位。
（5）GUS 酶活性检测 β葡萄糖苷酶（β‐glucuronidase，GUS）能催化裂解一系列的β‐葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS 活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。GUS 基因的最大优点是它能研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。但一些植物在胚胎状态时，能产生内源GUS 活性，因此在检测GUS 活性时，要注意植物的发育时期和取材部位，并设定严格的阴性对照。
3.其他检测技术
（1）基因芯片
将大量的探针按特定方式固定在支持物上，与标记的样品进行杂交，通过检测每个探针杂交信号的强度，可以判断该样品是否含有转基因成分。基因芯片技术可以同时对数以千计的样品进行处理分析，大大提高了检测效率，降低了检测成本。目前，已经有商品化的转基因检测芯片试剂盒，可对指定的转基因作物中的几种转基因成分做定性检测。
（2）色谱分析
当转基因产品的化学成分较非转基因产品有很大变化时，可以用色谱技术对其化学成分进行分析，从而鉴别转基因产品。还有一些特殊的转基因产品（如转基因植物油等），无法通过传统的外源基因或外源蛋白质检测方法来进行检测，可以借助色谱技术对样品中脂肪酸或甘油三酸酷的各组分进行分析以达到转基因检测的目的。该方法是一种定性检测方法，对转基因与非转基因混合的产品进行检验时准确性有限。
（3）表面等离子体谐振生物传感器技术（surface plasmon resonance，SPR）
生物传感器是将探针或配体固定于传感器芯片的金膜表面，含分析物的液体流过传感器芯片表面，分子间发生特异性结合时可引起传感器芯片表面折射率的改变，通过检测SPR 信号改变而监测分子间的相互作用。Feriotto 等（2002）将这种方法与PCR相结合，将用生物素标记的PCR产物固定于传感器表面并用相应的探针进行杂交，成功检测了转基因大豆。与传统的分析技术相比较，它具有实时监控、无需标记、耗样量极少等特点。
（4）光谱分析法
有的转基因过程会使植物的纤维结构发生改变，通过对样品的红外光谱分析可对转基因作物进行筛选。以转基因玉米及其亲本为实验材料，借助于近红外光谱仪对转基因玉米及其亲本进行识别分析，结果显示，通过扫描光谱及数学和计算机软件分析，非常准确、方便地识别了转基因农产品。近红外线光谱分析法的优点是不需要对样品进行前处理，具有无污染、成本低等优点，是一种极具前景的转基因食品安全检测识别技术，但它不能对转基因与非转基因混合的产品进行检验，且准确性有限。
以上方法分别从基因表达的不同水平，对目的基因或报告基因进行检测。但利用报告基因检测到的阳性植株，不能保证目的基因完整整合到植物染色体上，还需进一步检测。PCR检测方法灵敏度高，操作简单，既能定性又能定量，在目前转基因检测中应用最为广泛，未来改进的重点在于提高定量PCR的测量限度（LOQ）和定性PCR的检测限度（LOD）。免疫分析技术需改进的重点在于如何用免疫分析技术进行转基因成分的定量检测以及如何降低免疫分析技术的成本。微阵列、生物传感器等微型、高通量、自动化的技术可以满足日益增加的转基因产品，如何提高它们的灵敏度并应用于定量检测也是目前的研究热点。在实际工作中多把几种方法结合运用，以获得外源基因不同表达水平的信息。总之，高灵敏度、高通量、自动化、低成本是转基因检测技术将来的发展趋势。
