基于AC/DS转座系统建立的转化载体，Lebel等人借助于该系统，通过基因直接转化法，把10kb的大片段以完整单拷贝的方式整合进受体细胞基因组；利用细菌噬菌体P1Cre-lox，酿酒酵母FLPfrt和结合酵母Rrs 位点特异性重组系统，这类系统可将外源基因以单拷贝、位点特异的方式整合到事先整合有lox，FRT，rs位点的植物上，Albert 等研究小组先后成功地利用细菌噬菌体P1Cre-lox 系统将T-DNA以单拷贝、位点特异的方式整合到烟草和拟南介中，实现了转基因的稳定表达。
6.选择合适的转化方法
目前，植物基因工程中外源基因常用的转化方法有农杆菌介导法和基因枪法。基因枪法导入的外源基因为多拷贝，易导致目的基因发生沉默。农杆菌介导法能够减少导入外源基因的拷贝数，降低基因沉默发生的比例。
7.选择单拷贝转基因植株单拷贝个体的筛选可以在分子水平进行，如利用Southern杂交来确定；也可以在育种过程中进行，如采用常规的杂交、回交等方式，通过分析后代分离比来确定。筛选到单拷贝基因个体后，要对转基因纯合株系转基因表达的稳定性进行鉴定，从而达到防止子代出现转基因沉默的目的。
10.6.2转化后抑制策略
1.去甲基化
大多数基因沉默现象都与基因的甲基化密切相关。甲基化均是从启动子区开始的，可延伸至目的基因的3′端，发生在DNA的CG 和CNG 序列上的胞嘧啶甲基化对维持转基因沉默是必需的，对于已经发生转基因沉默的植株通过采取去甲基化的措施可以使沉默的基因重新表达。主要的去甲基化试剂是二羟基丙基腺嘌呤或5氮胞苷，经过它们处理可使转基因序列非编码区约30%的胞嘧啶去甲基化，转基因水平相应提高12倍，但这类试剂使转基因植物普遍出现各种不利性状，且5氮胞苷价格昂贵并具有致癌性，故无实用价值。
2.去除MOM 基因
MOM 是一种编码核蛋白的基因，参与染色质重构。已有报道用突变MOM 基因或通过其反义RNA的表达来消除MOM 转录的mRNA，可以使几种已经沉默的高度甲基化的位点恢复转录活性。
3.甲基化作用相关基因的去除
既然基因沉默大多数情况下是与DNA序列甲基化有关，那么可以将与甲基化有关的基因去除，或者使其沉默从而消除其转基因的沉默。如DNA甲基化转移酶与转基因沉默有关，用RNAi 技术去除水稻中的DNA甲基化转移酶，能消除由于甲基化导致的转基因沉默。但是去除某些与沉默有关的基因后对植物正常生理活动的影响需要进一步研究。
4.病毒抑制因子
在病毒与植物长期的协同进化过程中，植物通过PTGS 机制对病毒产生抗性，而病毒也进化出抑制PTGS 的蛋白抑制因子，能抑制PTGS 的启动和保持以及传导。因此，一些病毒的蛋白因子，如烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）、黄瓜花叶病毒蛋白（CMVb）和马铃薯X 病毒蛋白（P25）等可以用来抑制植物转基因沉默。
植物转基因沉默的机制尚未被人们完全掌握，但是通过一些策略和方法，人们已经能够防止或者抑制转基因沉默的发生。另外，植物转基因沉默的诱因除了基因本身之外，环境因素对于转基因沉默的发生也有一定的影响，进一步摸索环境因素的影响也是攻破植物转基因沉默的一个重要方面。
10.7转基因植物的安全性和对策
目前对转基因植物的安全性评价一方面是环境安全性，另一方面是食品安全性。环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间后，是否会将所转基因移到野生植物中，是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡，这包括：①转基因植物演变成农田杂草的可能性。②基因漂流到近缘野生种的可能性。③对生物类群的影响。
关于食品的安全性评价，目前通用的是采用实质等同性原则，即通过对转基因食品各种主要营养物质成分、毒性物质以及过敏性成分等物质的种类与含量进行分析，如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的；反之，则应进行严格的安全性评价。在进行实质等同性评价时，一般要考虑以下主要方面：①有毒物质。必须确保转入的外援基因或基因产物对人畜无害。②过敏源。在自然条件下存在着许多过敏源，在基因工程中如果将控制过敏源形成的基因转入目标植物，则会对过敏源造成不利的影响。
在转基因植物中，导入植物体内的外源基因通常包括两类：一是目的基因，它是用来优化或赋予植物特定性状的基因；二是标记基因，它能赋予转基因植株抗抗生素或抗除草剂等特性而提高转基因植物筛选的效率，但转化成功后仍保留在转基因植物体内的这些抗性标记基因不仅影响了二次转化，而且还存在安全性问题。随着越来越多的转基因植物不断地在自然界释放，转基因植物中标记基因的生物安全性已成为人们关注的一个焦点。目前的试验水平还不能对抗性标记基因进行准确的安全性评价，从而加剧了人们对转基因植物安全性的忧虑。
提高转基因植物中标记基因的安全性有3种策略：①转化时使用抗性标记基因，转基因成功后将该基因彻底剔除；②使用安全的筛选标记基因；③完全不用标记基因。
10.7.1抗性标记基因的剔除技术
抗性标记基因的剔除技术包括共转化、位点特异重组系统、转座子和同源重组等剔除标记基因的方法。
1.共转化法
共转化法是将选择标记基因和目的基因分别构建在不同的载体或同一载体的不同位点上，一起转化受体细胞，通过筛选和分子鉴定获得两者共整合的转基因植株，其中一部分转化植株中标记基因和目的基因是不连锁的，再经后代的有性分离获得仅含目的基因的转基因植株。根据所使用的农杆菌的种类、质粒的种类以及T‐DNA在质粒上的数量的不同，共转化又可分为3种方式：①一种或多种农杆菌介导多个质粒的共转化，共转化效率可达到50%或更高；②将目的基因与标记基因构建在同一个Ti 质粒的不同的T‐DNA区上，通过一种农杆菌进行共转化；③将目的基因和标记基因分别置于同一质粒T‐DNA区的左右边界的内部和外侧，相对于含有多个T‐DNA区的双元载体而言，这个只有两个边界的双元质粒能提高共转化以及非连锁整合的概率，从而能更有效地产生无标记基因的转基因植株。由于该方法必须经过有性世代才能够获得无标记基因的植株，不适用于无性繁殖的品种。
2.位点特异性重组系统
位点特异性重组系统是指通过重组酶作用于两个特定DNA序列实现重组，该系统由重组酶及其识别位点组成，当两个识别位点正向排列时，重组酶可专一性地催化切除两个识别位点之间的序列。在剔除标记基因技术中常用的是大肠杆菌噬菌体P1的Cre/loxP 重组系统。
Dale等将hpt标记基因置于2个loxP位点之间，与目的基因一起转化烟草，再将cre基因通过二次转化导入烟草，结果与预期相同，检测表明剔除了hpt 标记基因。在杂交方案中，首先分别将置于2个loxP位点之间的标记基因和cre基因导入植株，再将相应的转基因植株杂交，结果在F1代中标记基因得到剔除，最后在F2代中可分离得到只含有目的基因的转基因植株，但这一方法使用起来周期长，效率低。另一方面，已有证据显示cre基因在转基因植物中长期高水平表达可能导致植株叶子变黄、生长迟缓和育性降低等生长发育不良现象。相比之下，诱导型表达cre基因自动剪切剔除标记基因的方法不失为一种优秀的策略。该策略是将cre基因、标记基因、目的基因等元件紧密排列在同一个T-DNA区，其中受诱导型启动子控制的cre基因、标记基因位于2个正向loxP 位点之间，因此，cre基因的表达受诱导型启动子的严格调控，当标记基因完成筛选任务不再需要时，通过一定的化学或生理条件诱导cre基因的表达，从而只需一次转化就能高效地剔除标记基因获得仅含目的基因的转基因植株。以上剔除标记基因的方法中，诱导型自动剔除标记基因的体系有以下优点：①适用范围广，对有性繁殖和无性繁殖的植物品种均适用；②过程简化，既不需要通过二次转化或有性杂交导入cre基因，也不需要通过第二代的有性分离再来剔除cre基因，大大节约了时间，缩短了实验周期；③可按需要严格地掌握标记基因的剔除时机，也排除了cre基因的长期表达带来的不利影响。
3.转座子、同源重组及其他剔除标记基因的策略
转座子系统普遍存在于植物界，而且通常一种植物转座子系统在异源植物中也能自由转座。当前应用较多的仍是最早发现的玉米A c/Ds 转座子系统，在此体系中，Ac能够自发转座，Ds则只有当A c存在时才能够转座。利用这些特性，可将目的基因置于Ds 之间或者将标记基因插于Ac中间，转基因完成后，目的基因和标记基因将随着转座作用而发生分离，从而获得无标记基因的转基因植物。同源重组法是将标记基因置于重复序列之间，通过两个重复序列发生重组作用，从而将标记基因切除。除了以上的方法以外，科研工作者们尝试着用其他物理方法来消除转基因植株中的标记基因，如Tinoco等成功地用γ 射线照射的方法剔除了转基因大豆中的标记基因，但由于效率太低，尚未见在其他植物的应用。
10.7.2安全标记基因
与传统的抗性标记基因不同，安全标记基因无抗生素或除草剂等抗性，因此，它对生态环境和生物健康来说是安全的。利用这些安全标记基因可使转化的细胞正常生长，非转化细胞的生长发育则受到抑制，从而有效地筛选出转化细胞和植株。
目前这类选择标记基因主要有2类：一类是有关激素代谢的基因，例如ipt （异戊烯转移酶）基因、iaaH（吲哚3乙酰胺水解酶）基因。这类基因可通过调节植物体内激素代谢而使转化细胞的生长与分化不同于非转化细胞，从而有效筛选出转化细胞和植株，但这类基因也易导致激素过量使得转化植株生长发育呈现畸形，因而这类标记基因也常与位点特异性重组酶系统或转座子系统结合使用，使其最终从转基因植株中剔除。
另一类是有关糖代谢的基因，例如甘露糖磷酸异构酶（phosphomannose isomerase，pmi）基因和木糖异构酶（xylose isomerase，xylA)基因。pmi 编码的6磷酸甘露糖转移酶可催化6磷酸甘露糖转变为6磷酸果糖， xylA 基因编码的木糖异构酶能催化D 木糖与D 木酮糖的可逆转变，在仅含甘露糖（或D 木糖）作为碳源的培养基上，非转化细胞由于不能利用甘露糖（或D 木糖）作为碳源而被淘汰，整合了外源pmi 基因（xylA 基因）的转化细胞则能够利用甘露糖（D 木糖）作为碳源而正常生长。目前， pmi 和xylA 基因成功地用作马铃薯、烟草、西红柿、水稻、玉米、小麦、大麦和甜菜等作物遗传转化体系的标记基因，并获得了较为安全的能够正常生长的转基因作物。与npt Ⅱ等抗性标记基因相比，以糖类代谢相关基因作为选择标记基因不仅安全，而且具有更高的转化效率，与激素类标记基因相比，糖代谢相关标记基因一般对植物的正常生长没有影响，可以不剔除。
安全的非抗性标记基因被认为是提高植物转基因安全性的一条主流，尤其是糖代谢相关的标记基因，由于此体系以价格低廉的糖类物质作为筛选剂，同时筛选程序简单，筛选效果显着，因此以糖代谢相关基因作为标记基因的植物转基因体系具有广阔的应用前景。
