10.7.3无标记基因的安全策略
5.利用转化和重组系统
目前所使用的植物转基因手段，无论是基因枪法还是农杆菌介导法，如果不使用合适的标记基因，则在后期难以筛选到含有目的基因的转基因植株。相比之下，如果不使用标记基因就能获得只含有目的基因的转基因植株，应该是最直接有效的方法。随着超强毒性农杆菌菌株的发现和PCR技术的普及，de Vetten 等将这一设想变成了现实。他首先将含有目的基因但无其他任何标记基因的双元载体分别导入常用的农杆菌菌株LBA4404和强毒性农杆菌菌株AGLO 中，并分别与茎外植体进行共培养，收获外植体上的再生芽于MS 培养基中培养诱导成苗，PCR鉴定显示AGLO 转化的阳性率平均为4.5%，进一步分析220株PCR阳性的Karnico 品种转基因植株中100株（45%）出现了完全预期的表型，表明结合应用强毒型农杆菌菌株、PCR鉴定筛选技术和优化的基因转化载体即使在没有使用标记基因的条件下也能获得大量的含目的基因的转基因植株。由于理想的转基因植物应该是除了含有目的基因之外，不应含有载体DNA骨架或多个T-DNA插入等多余DNA的转基因植株。他们通过多重PCR和Southern杂交鉴定出的99株有预期表型的转基因植物中共39株不含载体骨架DNA，其中有10株仅含单拷贝目的基因的转基因植株。这表明采用这一转基因方法能够获得既无标记基因又无载体骨架DNA且仅含单拷贝T-DNA插入的转基因植株。
与其他获得无标记基因的转基因植株的方法相比，本方法具有不需要遗传分离或二次转化等步骤，也无需考虑转座或重组的片断重新插入到基因组的情况；可获得既无标记基因又无其他非必需DNA的大量转基因植株等优点。但当前该方法仅在马铃薯和木薯等植物中报道，尚有待进一步的推广。
转基因植物安全性是一个与人类自身生活密切相关的复杂问题，直接关系到一种转基因植物品种的未来命运。随着转基因植物不断地商业化，人们越来越重视由此带来的安全问题。
前述的安全策略中，无标记基因的方法最为理想，通过这一方法获得的转基因植株既无标记基因也无其他多余的DNA序列，但目前仅局限于马铃薯和木薯，要使这一策略成功地应用于植物育种，还需要做大量的研究工作。
10.8转基因植物的应用
10.8.1转基因植物的应用
1.培养抗虫、抗病毒的转基因植物
全世界每年因病虫害损失大量粮食，为降低农药用量、减轻环境污染和减少经济损失，急需培育抗虫转基因品种。抗虫基因主要有毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物凝集素基因和淀粉酶抑制剂基因。苏云金芽孢杆菌Bt 晶体毒素蛋白基因是最早被利用的杀虫基因。Bt 基因对哺乳类动物、鸟类、鱼类和一些有益昆虫不产生毒害作用，也不造成环境污染，目前全球已获得了50多种转Bt 基因植物。
病毒病是农业生产中较难对付的主要病害之一，会造成农作物产量降低与品质变劣。人们通过导入植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因、核糖体失活蛋白基因、干扰素基因等来提高植物抗病毒的能力。目前用得最多的是病毒的外壳蛋白（CP）基因。现今利用CP 基因培育成功的有烟草、番茄、马铃薯、首清等抗病毒转基因作物。
2.培养抗除草剂的转基因作物
杂草是严重影响作物生长的因素之一，大量施用除草剂虽然能抑制杂草的生长，同时也对作物造成一定的伤害。抗除草剂转基因作物是通过基因工程技术将抗除草剂基因克隆到作物中，赋予其抗除草剂的新特性。目前市场上较多的是抗草甘膦和抗草丁膦转基因作物。
3.提高植物的抗逆性
植物对逆境的抵抗一直是人们关心的问题，为提高植物对干旱、低温、盐碱等逆境的抗性，研究人员把这些逆境基因克隆后转入植物，使其获得抗性。我国在抗盐基因工程上已取得了一些进展，先后克隆了脯氨酸合成酶（proA）、山菠菜碱脱氢酶（BADH）、磷酸甘露醇脱氢酶（mtl）及磷酸山梨醇脱氢酶（gutD）等与耐盐相关基因，通过遗传转化获得了耐1%NaCl的苜蓿，耐0.8%NaCl 的草莓及耐2%NaCl的烟草，这些转基因植物已进入田间试验阶段。
中国科学院遗传所将BADH 基因导入水稻，获得的转基因水稻有较高的耐盐性，并能在盐田中结实。
4.改良作物的营养品质及延长果实的货架期
随着人们生活水平的提高，人们对饮食质量的要求越来越高。利用转基因技术可以有效地改良植物的营养成分、口感、观赏价值等品质性状。作物种子蛋白是人类和牲畜日常蛋白质的主要来源；与肉类相比，植物蛋白质的氨基酸比例不合理，主要表现在禾谷类单子叶植物种子蛋白质中的赖氨酸和色氨酸含量低，而豆类和蔬菜类等多数双子叶植物蛋白质中缺乏蛋氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸。目前科学家们按照人类的意愿，已对不同作物的蛋白质、碳水化合物、油脂、微量元素和维生素等营养物质进行了成功的改良实验，已获得许多有应用价值的转基因作物品系。北京大学已将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需氨基酸的马铃薯品系。中国农业大学成功地将高赖氨酸基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸含量比对照提高10%。国外科学家成功地将维生素A 合成的关键基因导入到水稻中，并能够在水稻的种子中组织特异性表达，生产出含有维生素A 的稻米。在控制植物果实发育的基因工程中，华中农业大学获得了延迟成熟的转基因番茄，与未转基因番茄相比，显着延长了贮存时间，1997年农业部基因工程安全委员会已批准这种耐储存番茄进行商业化生产。
5.生产药用蛋白质
利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白的研究逐渐受到各国的重视，研究探索的热点之一是利用转基因植物生产口服疫苗。目前，香蕉、番茄、烟草、马铃薯、莴苣等植物都已被用来生产食用疫苗。中国农业科学院生物技术研究所的科研人员将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和番茄，饲喂小鼠试验检测到较高的保护性抗体，浓度足以对人类产生保护作用。利用转基因植物生产口服疫苗可以大大降低疫苗的生产成本，在发展中国家更有良好的发展前景。
10.8.2转基因植物研究发展趋势
转基因植物技术的大规模产业化具有巨大的经济效益，可以显着地降低成本，提高劳动生产率，改造传统产业，开辟新的产业领域，建立新的经济增长点。随着研究与开发的不断深入，出现了3个明显的趋势。
1.对生物基因资源及其知识产权的争夺白热化
在巨额经济利益的驱使下，发达国家对生物基因资源及其知识产权展开了激烈的争夺，其核心是对农业主要栽培作物基因的争夺，主要表现在基因资源的鉴定、分离及其克隆的竞争。
2.研究方式集约化，科学设施大型化、规模化和自动化
发达国家，特别是欧美等国家转基因研究的方式已开始向集约化方向发展，他们从事转基因研究的专业实验室所需要的研究设备已做到大型化、规模化、自动化，且转基因技术的技术标准体系完善，法规健全，环境保护意识强。尽管其转基因研究所采取的技术主要也是农杆菌介导、基因枪介导、病毒介导、化学物质诱导、离子束介导等，但他们技术更新的速度快，培育的新品种多及推广快。
今后的发展趋势是对现有转基因技术体系进行完善与创新，建立起高效大规模的转基因技术体系，对每一个不同的植物品种建立具有独立自主知识产权的研究方法和技术体系，满足新种质创造与基因功能验证的要求。对已获得的种质材料，进行转基因育种体系的建设，培育出具抗病虫害、抗除草剂等性状的水稻、小麦以及具抗黄萎病、纤维品质改良性状的棉花等转基因新品种。在新基因与新种质开发方面，主要是对具有生产应用价值的棉花抗黄萎病新基因与纤维改良基因、水稻等作物的除草剂基因等，并以这些基因为目的基因通过规模化转基因技术创造出大批量的种质材料。在转基因新技术方面，主要是通过建立起棉花、水稻等作物的质体转化技术体系，以提高作物光合产率、肥料利用率、不育基因等为目标，获取新种质、新材料。在转基因植物快速检测技术方面，主要是对棉花、水稻等农作物转基因材料的快速检测技术加以研究，以满足对大批量材料的准确、低成本、高效检测需求，其重点为检测试纸的研制等。
我国1999年启动实施“国家转基因植物研究与产业化”专项，重点开展功能基因克隆、转基因新材料创制、基因转化核心技术创新、新产品培育和产业化、转基因植物安全性评价等研究。目前植物转基因核心技术取得突破，植物重要功能基因的分离克隆研究取得重要进展，获得了包括水稻分蘖基因MOC1、融合抗虫基因CryCI、新型抗除草剂基因、隐性抗水稻白叶枯病基因xa5和xa13等一批具重要应用价值并拥有自主知识产权的新基因。
高效、安全植物转基因核心技术取得突破，技术体系初具规模。在选择标记基因删除技术和目的基因产物定时降解技术、无选择标记的转基因技术等植物转基因核心技术创新方面取得重大突破；初步建立了棉花、水稻、油菜、玉米、大豆、花生、杨树等主要农作物和林草、花卉、果树高效、安全转基因技术体系，大大缩短了我国与世界先进水平的差距。创制了一大批优质、抗病、抗虫、抗旱、耐盐、抗除草剂转基因作物新品种、新品系和新材料，为转基因植物产业化奠定了扎实基础。共获得了转基因抗虫、抗病、抗逆、品质改良、抗除草剂等水稻、玉米、小麦、棉花、油菜、大豆以及主要林草等新株系和新品系20925份，新品种58个。建立了较为完善的国家植物转基因研究开发体系、国家植物基因研究中心、转基因植物中试及产业化基地的建设，为我国植物基因研究及生物技术育种提供了先进的基础设施和技术平台。
本章小结
植物转基因技术是将人工分离或修饰过的目的基因利用DNA重组技术整合到植物的基因组中，由于外源基因的表达，赋予受体植物新的特性。植物转基因技术包括：目的基因的克隆、外源基因的转化和转基因植物的再生。
目的基因的导入主要有农杆菌介导法。其他转化方法包括：化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、微注射法、花粉管通道法、离子束介导法和基因枪法等。
外源基因在转基因植物中有的表达量很低，甚至不表达，这种基因失活的现象被称为基因沉默。根据对现有转基因植物的分析和研究，外源基因沉默一般可归为两种类型：
转录水平上的基因沉默（TGS）和转录后水平上的基因沉默（PTGS）。外源基因能否在植物体内稳定地整合、遗传和表达就决定了转基因植物的使用价值。根据转基因沉默抑制策略的时间先后，可以将抑制策略大致分为转化前防止与转化后抑制。大多数基因沉默现象都与基因的甲基化密切相关，可以将与甲基化有关的基因敲除，对于已经发生转基因沉默的植株通过采取去甲基化的措施使沉默的基因重新表达。
目前对转基因植物的安全性评价一方面是环境安全性，另一方面是食品安全性。在转基因植物中，导入植物体内的外源基因通常包括两类：一是目的基因；二是标记基因。
提高转基因植物中标记基因的安全性有三种策略：转化时使用抗性标记基因，转基因成功后将该基因彻底剔除、使用安全的筛选标记基因和完全不用标记基因。
转基因植物的应用包括培养抗虫、抗病毒的转基因植物、培养抗除草剂的转基因作物、改良作物的营养品质及延长果实的货架期、生产药用蛋白质等多方面。
思考题
1.简述转基因植物食品安全性评价中采用的实质等同性原则。
2.试述转基因植物发生基因沉默的可能原因和防止策略。
3.试述转基因植物的安全性风险和目前的解决方案。
（王为民）
