与基因剔除相比，这项技术具有操作过程简便，抑制基因功能的不完全性和可调控性等优点，但是由于RNAi 的机制至今仍未解释清楚，很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果，而且由于RNAi 并不像基因敲除那样100%地把基因从基因组中剔除掉，所以有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。前者面临的问题会随着对RNAi 机理的探明而得到解决，而后者则是由于RNAi 本身的性质决定的。目前只有基因敲除小鼠或基因突变小鼠能达到基因水平的剔除或灭活。因此，在研究工作应根据具体的研究目标选择转基因动物的制备方法。
转基因动物技术经过多年的发展，在技术的多样性和实用性方面都取得了显着进步，从起初的显微注射方法，到近年来发展的体细胞克隆技术，给制备转基因和基因打靶大型动物提供了手段，使人们在制备转基因动物时的选择性增多。但在制备技术方面和应用范围上，都还存在很大的发展空间。
11.2转基因动物的检测
由于外源基因整合到受体动物基因组中，存在着拷贝数低、基因表达效率低、不表达、外源基因与内源性基因同源性高以及嵌合体等问题，所以有必要选择适当的检测方法，确认目的基因整合到受体动物中后是否能够稳定遗传和发挥功能。
11.2.1染色体和基因水平
1.DNA斑点杂交
DNA斑点杂交（DNA blot hybridization）是通过直接将变性的待测DNA样品点在尼龙膜（或硝酸纤维素膜）等固体支持物上，然后和探针杂交，从而检测样品中是否存在目的DNA序列。该方法具有快速、简便、灵敏度高（能从2～5μg 基因组DNA中检出单拷贝基因）等优点，适用于对大批子代转基因动物进行初筛，但易出现假阳性。
2.PCR技术
PCR技术是DNA体外扩增技术，在转基因动物研究中，用PCR先对着床前的胚胎进行筛选，再将阳性胚胎植入母体，可极大地提高转基因效率。但该方法易出现假阳性，仅用于转基因动物的初步检测。
3.Southern印迹法
Southern印迹杂交技术是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上的经酶切、电泳分离的变性DNA链杂交，检测样品中是否存在目的DNA序列的方法。该法不仅灵敏而且准确，并且通过对多种（ ≥ 5）限制性内切酶酶切后的Southern杂交结果分析，可以初步确定外源基因整合的拷贝数，因而广泛用于转基因动物的筛选和鉴定。
4.染色体原位杂交
染色体原位杂交（in situhybridization）是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段，其原理是利用碱基互补的原则，以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA片段作探针，与染色体标本上的基因组DNA进行杂交，经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察目的DNA片段在染色体上的位置。
11.2.2转录水平
在mRNA水平检测外源基因是否表达，其中常用的有Northern 印迹法、实时荧光定量PCR、基因芯片等方法。
1.Northern 印迹法
该方法是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上的RNA分子杂交，检测样品中是否存在目的RNA序列。该技术操作简便，在转基因和内源基因同源性较少时，可用于转基因表达的检测。
2.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于各种基因的定量表达分析。
3.基因芯片
基因芯片又被称为DNA芯片、DNA微阵列和生物芯片，是指以大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针，按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、载玻片或塑料片上。使用时先将需分析的样品标记，然后与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交，再用激光共聚焦显微镜等设备对芯片进行扫描，配合计算机软件系统检测杂交信号的强弱，从而高效且大规模地获得相关的生物信息。此项技术克服了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等的缺点。此外，通过设计不同的探针阵列（array）， 利用杂交谱重建DNA序列， 还可实现杂交测序（sequencing byhybridization，SBH）。目前，该技术在基因表达研究、序列分析及基因诊断等领域已显示出重要的理论和应用价值。
其他方法，如RNase 保护分析等也用于外源基因的转录水平检测，具有较高的灵敏性、不受同源性限制的优点，但操作步骤繁琐，目前应用较少。
11.2.3翻译水平
在蛋白质水平检测转基因是否表达包括两个方面，即转基因的mRNA是否被翻译和被翻译的蛋白质是否有生物学功能。
1.Western 印迹分析
该方法是对非放射性标记复杂蛋白质混合中的某些特定靶蛋白进行定性鉴别及定量分析的方法，实验过程是在固相支持膜上进行，可检出1～5ng 中等大小的待检蛋白。缺点是由于在这一实验中靶蛋白是彻底变性的，故并非所有单克隆抗体都适合用于Western 印迹。
2.酶联免疫法（ELISA）
该方法以酶作为标记物或指示剂，进行抗原或抗体的检测，具有特异性高、所需仪器设备简单、试剂价廉、无放射性危害等优点。ELISA 方法中所用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶等。一般来说，Western 印迹法更适用于少量样品的定性检测，而ELISA 方法可一次方便检出几十甚至几百个样品。
3.免疫荧光抗体法
利用待检细胞株先后与第一抗体（目的蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体）、第二抗体（葡萄球菌蛋白质A‐FITC 或抗鼠Ig 标记荧光素）反应，再用荧光显微镜观察照相。该方法简单易行，无需进行蛋白质的提取，适用于表达蛋白质的定性研究。
4.免疫沉淀法
利用免疫反应沉淀已被放射性标记细胞提取物中的靶蛋白，可应用于复杂蛋白质混合物中靶抗原的定性与定量，整个实验过程是在液相中进行，其独特优点是高选择性、特异性及敏感性，可检出低至100pg 的放射性标记蛋白。此法也还可被用于非标记蛋白的分析，当靶蛋白与抗体解离后，可使用如酶活性检测、Western 印迹分析等方法检出特定的非标记蛋白。
免疫沉淀法与SDS‐PAGE 结合应用是研究转基因动物细胞表达外源抗原蛋白合成与加工过程的理想技术。
5.活体动物体内成像（invivo imaging）
这项技术包括生物发光成像和荧光成像，采用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光作为体内生物光源，与新型冷CCD 成像相结合，实时探测活体动物体内生理或病理条件下的细胞活动和基因行为。冯娟等把DsRed‐Express 和EGFP 基因插入chicken β-actin 强启动子下游构建转基因载体，建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BLP6J 小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察，DsRed-Express 转基因小鼠的红色荧光蛋白和EGFP 转基因小鼠绿色荧光蛋白在胰腺、脑组织等多个组织器官中表达。该技术具有操作简便，可以实时定量检测目的基因的表达，是一项敏感的检测技术。
6.生物化学性质和生物学活性分析
除直接测定基因表达产物外，还可通过定性或定量测定表达产物的生物化学性质和生物学活性，来鉴定表达产物的存在。其指标有酶活力测定、受体蛋白分析和激素活性的检测等。
11.2.4其他
对于转基因动物来说除了以上分析方法外，还可以在动物整体水平上观察表现型的改变，进一步鉴定外源基因的整合与表达，以及对动物健康的影响。
综上所述，各种转基因检测方法各存利弊，因而在构建外源基因时应考虑到转基因的检测方法，选择（设计）的方法应尽可能精确、简便、经济易行。
11.3转基因动物技术存在的问题
11.3.1外源目的基因在宿主基因组中的行为难以控制
目前对外源目的基因的结构及其各种调控因子结合位点之间的关系、转基因过程中目的基因的整合机理、与宿主染色体之间的相互作用，以及相同的基因表达调控元件在不同种系的差异均未完全了解。目的基因的控制元件可能会缺乏宿主体内适当的调控和表达必需的重要序列，导致外源目的基因在宿主基因组中的行为难以控制，目的基因的整合和表达率低，即使已整合的外源基因也很容易从宿主基因组中消失，遗传给后代的概率很低。
另一方面，利用原核显微注射法生产转基因动物时，外源目的基因在宿主基因组中的插入是随机的，这可能会使内源基因遭到破坏或失活，也可能激活正常情况下处于关闭状态的基因，产生插入突变。同样也会影响目的基因自身的功能，由于受整合位点附近调控序列的影响，导致外源目的基因不表达或异位或（和）易时表达。伴随着主基因功能的丧失，受到干扰基因功能的影响，导致转基因阳性个体不育、胚胎死亡、四肢畸形、足趾相连等异常现象的发生。据Gordon 报道，转基因鼠中插入突变的估计频率大约为7%～20%。插入突变给动物带来了危害。
由于外源基因的异位或（和）易时表达，可能意外激活或抑制、改变动物体内一些正常生理过程，从而导致动物发育异常或疾病。Niemann 等报道，含有乳蛋白特异性基因启动子序列和预期在哺乳动物乳腺中表达的目的基因导入绵羊体内，检测发现在绵羊的心、脑等非特异组织中也能够表达。对带有编码促生长因子基因（bGH）的转基因猪研究表明，导入bGH 基因的转基因猪虽然明显地提高了生长速度和瘦肉率，高浓度血浆bGH 或hGH 对转基因猪的健康产生不利影响，对其进行临床检查和尸体剖检，发现转基因猪最常见的症状是嗜睡、步态不稳、突眼等，组织病理变化为胃溃疡、变性关节病、心包炎等。转基因不在特定组织中表达的原因可能是调节基因表达的顺式调控元件和反式作用因子之间的不协调造成的，也可能是宿主细胞基因和转基因之间的相互作用或转基因的整合位点不适引起的。
11.3.2转基因动物技术给动物带来的危害
由于现有每一种转基因制作方法自身缺陷的存在，从而影响了所生产的转基因动物的健康状况和生长速度以及其他一些方面的影响。这里主要讨论与转基因家畜生产有关的两种技术：原核显微注射法和细胞核移植技术。
利用原核显微注射法迄今为止已经生产了大量转基因动物。利用显微注射生产转基因牛要进行包括收集卵母细胞、卵母细胞的体外成熟、体外受精、显微注射后的体外胚胎培养和转移胚胎到接受者体中等一系列的操作。由于外源DNA在受体基因组中的整合位点是随机的，而且整合的拷贝数也是无法控制的，因此可能导致邻近内源基因的调控元件覆盖了转基因本身所在的位点，从而发生异常的表达模式（位点效应），包括不表达、加强表达或异常表达。另外，转基因的控制元件可能会缺乏适当的转基因调控和表达必需的重要序列，当转基因碰巧整合在具有重要功能的基因之中，就干扰了基因的正常表达，从而影响了转基因动物的正常发育与代谢。
细胞核移植是最近发展起来的一种生产转基因家畜的技术，用这种方法已经生产出了转基因牛和羊。有证据表明，在生产转基因牛和绵羊核移植过程中采用的与体内程序有关（如人工授精和体内胚胎发育）的体外技术可能导致机体产生有害的副反应，导致妊娠期流产率提高、先天畸形的增加和产期死亡率的提高。对由核转移或者是经体外胚胎培养在体外繁殖后得到的羔羊或小牛或死胎进行尸检，发现血管系统、尿道的发育不全、胸腺萎缩和脑部损伤等异常情况。这表明由于体外培养，胎儿器官和组织的发育模式发生了重大变化。但目前对于这一方面的机制仍不清楚，还需进一步的研究探讨。
11.3.3转基因动物的成功率和成活率极低，生产成本高
尽管也有少数成功率较高的报道，但目前公认的体细胞克隆成功率在1%～3%。克隆胚胎移植后的出生率平均不到10%。胎儿异常、流产和围生期死亡率高，出生后一周的死亡率最高可达100%。造成这种结果的主要原因可能是与各种操作过程中的胚胎损伤有关。因此，生产一头有用的转基因动物，需用大量供体和受体动物，涉及很高的研究费用。即使用体外成熟和体外受精方法，花费依然昂贵，导致转基因动物产业化受到很大限制。
