11.3.4转基因动物的安全性问题
伴随着转基因动物技术的发展，转基因动物及其产品的安全性、对生态环境的影响、伦理道德等问题也日益显露出来。此外，转基因动物研究中还面临着社会对转基因动物接受能力问题。对转基因动物自身安全性的问题进行透彻的理解和研究，不但可以提高和改进与转基因动物相关的技术，而且也可以为人类更好地利用转基因动物服务。
11.4提高外源目的基因的整合效率和表达水平的方法
11.4.1外源目的基因的整合效率和定位
一般来讲，通过显微注射方法将外源DNA导入细胞，从技术角度说受到DNA浓度、缓冲液的组成成分、外源DNA的构型和受体细胞周期等因素的影响。随着所注射外源DNA浓度的增加，整合效率也随之提高，但大量外源DNA的注射将使细胞成活率降低。一般采用细胞核注射，线状DNA分子整合效率远高于超螺旋DNA分子的整合效率。如将两种线性DNA分子共注射，其整合效率比共注射两种闭环DNA分子高20～70倍，且线性DNA能在宿主基因组中稳定整合。对不同细胞周期中外源基因的最佳整合时期研究表明，细胞分裂中期外源基因整合入细胞的效率最高（11%～47%）。Jankowsky 等用共注射法研究了双基因转基因动物的制作策略，一种是两种基因各带有自己的启动子元件，共注射入受精卵雄原核，另一种是把两种基因共同克隆于同一启动子的控制之下共注射，发现此两种方法相对于单基因均能提高基因整合的百分率。
外源DNA的整合有随机重组、同源重组和逆转录病毒整合等几种方式。转基因动物的研究表明，导入的外源基因几乎全部以随机的方式整合在受体细胞中染色体的随机位点上，因而转基因动物都面临着遗传稳定性差、易引起插入突变体和基因修饰所导致遗传病变等问题。Brinster 等提出假说：DNA随机整合在染色体DNA的断裂处，这些断裂决定其整合率，在注射的DNA末端和染色体断裂点之间的相互作用使外源DNA整合进基因组。由注入的DNA分子游离末端所诱导的修复酶可能引起染色体的随机断裂，断裂处可能就是外源DNA的整合位点。正因为如此，插入位点常出现宿主序列的重排、缺失、重复或易位，这些变化可能是注射后胚胎成活率不高的原因。
逆转录病毒整合的频率最高，有利于整合基因的表达调控，但该方法由于病毒容量的限制，要求外源DNA片段不能太大，且得到的动物是嵌合体，从而使逆转录病毒介导的方法在一定程度上受到限制。同源重组使外源DNA与受体细胞染色体上的同源序列发生重组，并整合到预定的位点上，改变细胞遗传特性，它能根据实验设计使哺乳动物细胞基因组结构进行定量定点改变，特异性很高，对靶细胞染色体的影响也很小，因而能定向改变细胞或整体本身的遗传结构和特征。利用同源重组的原理和胚胎干细胞培养技术，体外构建打靶载体，在受体细胞中通过一系列的体外转染筛选和制作胚胎嵌合体途径，获得含特定修饰的基因型或造成特定基因功能的缺失，这样一种基因操作技术称为基因打靶。基因打靶包括基因敲除（ knock out）和基因敲入（ knock in）技术。目前利用以上技术已经获得了通过基因敲入的转基因小鼠，实现了外源基因在宿主基因组的定点整合。
但是由于目前尚未建立起一套有效的、完善的适用于任何物种胚胎干细胞的分离和培养方法，到目前为止很多物种尚未得到胚胎干细胞，而体细胞便于采集，可以在体外增殖培养，所以通过对体细胞进行基因打靶，使外源基因定点整合到体细胞的基因组中，再结合体细胞克隆来生产转基因动物也是提高目的基因表达的一条途径。
此外，在制作转基因家禽时，可以对原始生殖细胞（PGC）进行基因打靶，van de Lavoir 等将携带能表达绿色荧光蛋白基因的PGC 注入孵化3d 发育至13～15期的鸡胚内，获得8只公雏，成长后与母鸡交配产生7只生殖腺有转入外源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为今后进行禽类的定点转基因提供了示范。
11.4.2外源目的基因的高效表达及调控元件
研究表明，启动子、内含子、增强子及插入整合的位点是决定表达的主要因素，此外还受到细胞反式调控因子、整合拷贝数、载体序列以及机体状态等因素的影响。
1.启动子
启动子决定了外源基因在体内能否表达及表达效率的高低。一般对非特异性表达基因而言，选用组成型或广谱型启动子与之重组。对特异型表达基因而言，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性，如组织细胞特异性启动子、生长发育特异性启动子和诱导特异性启动子等。对组织特异性启动子而言，其特异性的产生是由基因两侧翼或基因内部某些顺式调控元件与特定的反式调节因子相结合的结果。另一方面，要求所选用的外源基因具有内含子的真核基因，而不是用原核基因和真核cDNA，否则就会因内含子负调控区的缺失而丢失遗传反馈元件。
2.内含子
由于内含子中存在的增强子和其他转录调控元件可影响转录的起始和延伸，转基因动物中外源基因的有效表达还取决于转入基因是否含有内含子。Choi 等人把组蛋白H4启动子驱动的细菌氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因转入小鼠，研究发现CAT 基因的转录单位中带有异源内含子时，其CAT 活性比不含此内含子的相应转基因小鼠的CAT 活性要高5～300倍。
Brinster 采用含有内含子基因的基因组构件比采用cDNA提高表达10～100倍，证实内含子有利于基因的转录。因此，在转基因动物中用DNA比cDNA更适宜表达。
3.增强子
基因的启动子不是单独起作用的，它的活性还受到远端调控元件的影响，这种远端调控序列称为增强子。由于增强子的作用无方向性和位置性，外源DNA整合后可能受插入位点邻近部位宿主增强子序列的作用，因而基因带有增强子序列，将会有效地提高目的基因的表达水平。另外，研究发现，某些增强子具有组织特异性，对实现目的基因的组织特异性表达具有重要作用。
4.反式作用因子
反式作用因子不仅能激活不同种外源基因的转录，而且能结合到染色体的不同位点，同时，将一个基因的调节序列与另一个基因的结构序列重新组合可以产生新的组织特异性表达。一个反式作用因子可对几个基因表达起作用，且具有组织特异性。Gordon 等将人的Thy 1基因导入小鼠中，发现该基因的表达模式与人完全相同，也主要是在胰脏、血管内皮及外周神经中表达。
5.整合位点
转基因的整合位点是高度可变的，由于受整合位点周围染色质翼区的影响，使用结构相同的外源基因所制备的转基因动物，其表达水平存在着很大的差异，即使携带组织特异性调节元件的外源基因，其表达也并不一定具有明显的特异性，即外源基因的表达存在着位置效应，这种位置效应不仅影响外源基因的表达水平，而且也影响外源基因的表达模式，以致具有同一外源基因但不同染色体整合位点的转基因小鼠中，该基因的转录就在不同时期和不同组织中被激活。
6.载体及载体序列
在转基因动物的制作中，目前克隆载体的整体结构与效率已有极大的发展和改进，现在使用的载体除噬菌体、黏粒外，还有酵母人工染色体（YAC)、细菌人工染色体（BAC)和哺乳动物人工染色体（MAC）。其中酵母人工染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体，其大容量能保证巨大基因的完整性，可消除或减弱位置效应，从而提高外源基因的表达水平。
1999年，Fujiwara Y 等利用该载体成功地使人的生长激素基因在大鼠的乳腺中高水平表达，乳汁中激素含量达0.25～8.9mg/ml。此外，通过在目的基因两侧添加核基质附着区（MAR），能够增加目的基因的表达。因此，在转基因工作中需要考虑载体序列对表达的影响。
7.共注射
不同的基因构件以首尾相连的形式共整合，在某种程度上形成相对独立的区域，或形成一个开放的染色体域，将特定的高水平表达基因与构件共注射，可以协同作用，从而提高外源基因的表达水平。
11.5转基因动物乳腺生物反应器
转基因动物的问世，为利用基因工程手段获得低成本、高活性和高表达的蛋白质药物开辟了一条重要途径，即转基因动物制药（transgenic animal pharming）。转基因动物体内最理想的表达场所就是乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。从转基因动物的乳汁获取的目的基因产物不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白质经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为转基因动物乳腺反应器。利用转基因动物乳腺生物反应器来生产基因药物是一种全新的生产模式，具有投资成本低、药物开发周期短和经济效益高的优点。
