建立转基因动物乳腺生物反应器首先要保证目的蛋白在动物乳腺的特异性表达，目前用于转基因动物乳腺定位表达的调控元件主要有以下四类：第一类为β乳球蛋白（BLG）基因调控元件。第二类为酪蛋白基因调控序列，常用牛αS1酪蛋白基因和羊β酪蛋白基因的调控序列。第三类为乳清酸蛋白（WAP）基因调控序列。WAP 是啮齿类动物奶液中的主要蛋白质，在家畜奶液中没有WAP 的存在，但WAP 基因调控序列可以指导外源基因在家畜奶液中表达。第四类为乳清白蛋白基因调控序列。第三类和第四类可以指导外源基因的表达，但乳腺表达的特异性及表达量都不如第一类和第二类。
由于转基因动物制药的巨大发展前景，目前世界上有多家公司在从事这方面的研究。近年来，转基因动物制药的研究取得了极大的进展，2006年6月2日，美国Genzyme 转基因公司研制的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶（商品名：ATryn）的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会的批准，ATryn 的主要成分——重组人抗凝血酶具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显着效果。
转基因动物制药将为人类解决许多生命科学领域的重大问题，是蛋白质药物生产领域的一场革命，这就决定了在今后这方面的研究将不断深入，竞争也将更加激烈。尽管转基因动物乳腺生物反应器制药给人们展示了美好的前景，但转基因动物制药尚存在研制周期较长、前期投资大、成功率低等较多的技术问题需要解决。目前，我国“863”计划已将山羊乳腺生物反应器研究列为重大项目，1996年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子Ⅳ 的转基因羊，为我国在转基因动物制药方面的研究奠定了良好的基础。
11.6转基因动物的应用
11.6.1建立诊断和治疗人类疾病的动物模型
人类疾病的动物模型（animal model of human disease）是指医学研究中应用的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。用产生某些疾病或遗传病的基因作为外源基因，通过转基因技术来制作各种研究人类疾病的动物模型，用于研究某些人类疾病或遗传病发生的机制、治疗方法，以及药物的治疗效果等，为诊断和开展治疗类似的疾病积累宝贵的资料，使转基因动物在人类医学研究中体现重要价值。
如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种宿主特异性极强的嗜肝病毒，HBV 感染与慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关，但HBV 在自然状态下只能感染黑猩猩等少数几种动物，对这些病原体敏感、廉价的动物模型的寻找一直是各国学者坚持不懈奋斗的目标。目前已经建立乙型肝炎病毒核心抗原（ ayw 亚型）转基因小鼠模型，为研究HBV 在宿主体内的表达、包装以及分泌等生物学特性提供了良好的试验材料，也是抗HBV 药物和临床相关疾病治疗的理想动物模型。总之，转基因动物模型具有能在整体水平从时间和空间四维角度同时观察基因表达功能和表型效应的独特优点，能从分子水平上研究健康或疾病状态的生物体生理和病理情况。
11.6.2用转基因动物生产药用蛋白
20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物，或称基因药物。
高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展。
基因工程药物的发展主要经历了细菌基因工程药物，即把目的基因导入大肠杆菌等工程菌中，通过原核生物来表达目的基因蛋白。细菌基因工程的成功使大量生产人体内的稀有蛋白成为可能，改变了蛋白药物生产的传统模式。但是细菌缺乏真核生物基因所必需的一些翻译后加工机制，因此用于表达真核基因时的蛋白产物往往没有活性，必须经过糖基化、羧基化等一系列复杂的修饰加工后才能成为有效的药物，因而限制了细菌基因工程的发展。细胞基因工程药物，即利用哺乳动物细胞株来代替基因工程细菌来生产药用蛋白，克服了细菌基因工程制药的不足，用该方法生产的红细胞生成素（EPO）等已经上市。但是细胞基因工程也有不足之处，因为人或哺乳动物细胞培养条件相当苛刻，药物生产的成本太高，这样就限制了该方法的进一步发展。
利用转基因动物乳腺生产重要的蛋白质药物，即转基因动物制药。目的基因能稳定地遗传到下一代，用羊、牛等动物的乳腺表达人类所需蛋白就相当于一座药物工厂生产药物，具有投资成本低、经济效益高和没有污染的优点。
Berkel 等利用牛的αS1酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2kb 片段构建转基因载体，通过显微注射获得转基因牛，ELISA 结果分析表明，转基因牛奶中人乳铁蛋白的含量为300～2800μg/ml。其他目前已经能够从高等转基因动物乳腺反应器中生产的蛋白有抗凝血酶Ⅲ、长效组织纤溶酶原激活剂（tPA）、α抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅸ、乳铁蛋白等产品。但是用转基因动物进行药物生产还存在一些问题，如在转基因动物体内过量表达外源蛋白对动物造成的伤害，致使转基因动物在很多生理方面存在缺陷，这些问题需要进一步解决。
11.6.3生产可用于人体器官移植的动物器官
每年由于可供移植的人体器官不足，成千上万的病人因得不到移植器官而死去。因此，异源器官移植是解决世界范围内普遍存在的器官短缺的有效途径。排斥反应是器官移植的最大障碍，而利用转基因动物可以解决这一难题。如供体猪组织的血管内皮细胞表面存在糖类表面抗原，可与人类血清中的相应抗体结合，已知这种抗原是由α1，3半乳糖转移酶催化合成的，用基因敲除的方法降低该酶的活性或使该酶失活，从而解决异种器官排斥反应问题。此外还可以通过核移植技术建立病人的胚胎干细胞系，并在体外培养使其发育成为各种组织、器官，之后再移植给病人，这从根本上解决了排异反应，为生产可供人类移植用的器官开辟了一条很有希望的途径。
目前对器官供体动物研究较多的是猪。作为人类器官移植的供体，猪在解剖、组织及生理等方面与人类最为相近，其器官与人的器官大小相仿，并且容易饲养。
11.6.4基因动物在培养家畜新品种方面的应用
利用转基因技术可以加快动物改良进程。“超级小鼠”的成功使人们找到了一条加速经济动物生长的新技术途径。而且利用转基因技术有可能在较短的时间内培育出具有各种优良性状的家畜品种，培育出对某种疾病具有抵抗能力的转基因动物等。
11.6.5展望
虽然转基因动物还存在如对基因转移的过程和原理还不清楚、外源基因整合率低、转基因动物成活率低及转基因动物的安全性等问题，但转基因动物已经影响到工业、农业、医学及其他许多领域，特别是在医药生产和供人类移植所用器官的生产等方面，其经济效益和社会效益将是难以估量的。转基因动物生产将会成为生物工程技术领域最活跃、最具有实际应用价值的内容之一。因此，实现转基因技术实用化、商业化、转基因动物的产业化，是当代生物科学工作者的努力目标。
本章小结
转基因动物是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，使之具有新的稳定遗传性状的动物。生产转基因动物的基因转移技术主要有以下几种：原核显微注射法、体细胞核移植技术、反转录病毒载体感染法、精子载体导入法和胚胎干细胞移植法等。上述分别通过直接或间接地将外源基因导入配子、合子和早期发育的胚胎细胞中，再利用胚胎繁殖技术获得转基因动物。
外源基因整合到受体动物基因组过程中，存在着拷贝数低、基因表达效率低、不表达，以及嵌合体等问题。因而有必要选择适当的检测方法，确认目的基因整合到受体动物中。
检测技术有PCR技术、Southern印迹杂交技术、Northern 印迹法、实时荧光定量PCR、基因芯片技术、Western 印迹和酶联免疫法、活体动物体内成像技术等。
外源DNA的整合有随机重组、同源重组和逆转录病毒整合等几种方式。启动子、内含子、增强子及插入整合的位点是决定表达的主要因素，此外还受到细胞反式调控因子、整合拷贝数、载体序列以及机体状态等因素的影响。
从转基因动物的乳汁获取目的基因产物不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白质经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此转基因动物乳腺反应器是最理想的表达场所。
思考题
1.通过举例，详细阐述转基因动物乳腺生物反应器的制备过程。
2.简述目前生产转基因动物的关键技术中存在的问题及其发展趋势。
3.试解释基因打靶，并结合目前的研究现状，综述在转基因动物的制备中提高外源目的基因的整合效率和表达水平的方法。
（王为民）
